【摘要】：近年來,腎臟疾病及其并發(fā)癥的種類逐漸增多,成為威脅人類健康不容忽視的一類疾病。腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響,其中環(huán)境因子就是一類重要的影響因素。研究建立體外腎小管細(xì)胞在環(huán)境因子作用下發(fā)生的形態(tài)學(xué)及生理生化等變化的檢測(cè)評(píng)價(jià)手段,對(duì)于研究腎臟疾病尤為重要。本論文以大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E為模式研究對(duì)象,分別用不同濃度的葡萄糖和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)與NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),檢測(cè)它們對(duì)NRK-52E細(xì)胞生物活性的影響。利用原子力顯微鏡(AFM)力學(xué)檢測(cè)技術(shù),在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞形貌、高度、楊氏模量和粘附力的改變,并與生物學(xué)分析方法進(jìn)行結(jié)合驗(yàn)證。AFM檢測(cè)結(jié)果表明:葡萄糖(終濃度為5.5、10、25 mM)和CTGF(終濃度為0、2、10 ng/mL)刺激72 h后,細(xì)胞的形貌均由橢圓形逐漸變成長(zhǎng)梭形,細(xì)胞高度增加、粘附力降低、楊氏模量增高,且都呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系,當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)50 mM、CTGF濃度達(dá)50 ng/mL時(shí)細(xì)胞損傷嚴(yán)重,不再呈趨勢(shì)變化;免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)顯示E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)增加,熒光標(biāo)記顯示細(xì)胞骨架發(fā)生重排,MTT檢測(cè)細(xì)胞活力降低,且均與葡萄糖和CTGF濃度呈劑量依賴性關(guān)系。以上研究結(jié)果表明,葡萄糖或CTGF刺激均能使NRK-52E細(xì)胞發(fā)生損傷,降低細(xì)胞生物活性。本文利用AFM力學(xué)檢測(cè)技術(shù)和生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法,鑒定不同環(huán)境因子對(duì)腎小管細(xì)胞生物活性的影響,側(cè)重于細(xì)胞骨架重排和鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附研究,這些發(fā)現(xiàn)有助于為研究腎臟疾病提供新的研究思路。
【圖文】：

圖 1.1 （a）AFM 的原理示意圖，（b）力-掃描管位置變化曲線示意圖，實(shí)線代表趨近力曲線，虛線代表趨離力曲線，圖片來源于文獻(xiàn)[51]AFM 的工作模式主要有 3 種，分別為接觸模式（Contact mode）、非接觸模式（Non-contact mode）以及輕敲模式（Tapping mode），通常以探針針尖作用于待測(cè)樣品表面的作用力方式來進(jìn)行劃分。本文實(shí)驗(yàn)采用輕敲模式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行掃描成像，輕敲模式是介于接觸和非接觸模式之間的一種掃描模式。采用輕敲模式對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)樣品與針尖的接觸是非常短暫的，它們之間因接觸而產(chǎn)生的作用力微小，對(duì)樣品的損傷也會(huì)較小[52]。與接觸模式相比較，輕敲模式不僅能擁有高的成像分辨率，而且能夠大大減小針尖對(duì)于待測(cè)樣品表面形貌的改變[53]；與非接觸模式相比，輕敲模式對(duì)起伏較大的樣品表面感知更敏感，進(jìn)行掃描成像分辨率更高，因此測(cè)量較柔軟或黏性較大的樣品時(shí)可以優(yōu)先選擇輕敲模式[54]。在掃描過程中，保持 X-Y 平面不動(dòng)，懸臂梁在待測(cè)樣品表面以共振頻率的方式振蕩，驅(qū)動(dòng)探針針尖以速率的周期性短暫接觸樣品表面，并通過出來的光強(qiáng)差顯示在檢測(cè)器上來確定針尖在樣品上的振動(dòng)幅度。針尖在未接觸樣品表面之前做自由振蕩，振蕩幅度較大，一旦針尖距離樣品表面達(dá)到作用力閾值，探針便只在 Z 方向上趨近、觸

德國(guó) JPK 的 AFM，選用 MLCT 探針測(cè)量細(xì)胞的形貌和力學(xué)定 0.5-1 h，再開始進(jìn)行細(xì)胞測(cè)量。穩(wěn)定儀器時(shí)在超凈臺(tái)中進(jìn)行的死細(xì)胞和雜質(zhì)等洗掉，以防探針被污染導(dǎo)致測(cè)量數(shù)據(jù)不準(zhǔn)要先使用連接在光學(xué)顯微鏡側(cè)端的 CCD 相機(jī)獲得細(xì)胞顯微胞圖像一般由放大 100 倍的鏡頭獲取圖像，如圖 2.1，使用 C設(shè)置由 JPK 的 CellHesion200 軟件驅(qū)動(dòng)。將待測(cè)的細(xì)胞樣品壓電陶瓷，選擇液相模式，調(diào)試好激光位置后，通過力校準(zhǔn)將探針移動(dòng)到細(xì)胞核附近開始實(shí)驗(yàn)，采用輕敲模式進(jìn)行細(xì)胞的 256×256 像素點(diǎn)，圖像掃描最大范圍為 100×100 μm2，根掃描范圍。檢測(cè)細(xì)胞時(shí)應(yīng)用 Hertz-Sneddon 模型，如圖 2.1 所探針，探針的彈性系數(shù)為 0.05 N/m，，實(shí)驗(yàn)室溫度為 25℃，濕度為 3.10 V，測(cè)量細(xì)胞形貌時(shí)，模型掃描頻率為 0.3 Hz，測(cè)近和趨離速率為 1 μm/s，施加的力均為 0.6 nN，掃描速度均鏡和 AFM 裝置都設(shè)置在抗震臺(tái)上，所有的細(xì)胞信息均在相
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

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1 巫青;潘運(yùn)龍;皮江;林賈穎;張利國(guó);林唯棟;;順鉑誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的原子力顯微鏡研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2014年16期

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1 王巖;基于拉曼光譜和AFM力學(xué)信息研究PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的影響[D];長(zhǎng)春理工大學(xué);2018年

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本文編號(hào)：2632738