【摘要】：近年來,腎臟疾病及其并發(fā)癥的種類逐漸增多,成為威脅人類健康不容忽視的一類疾病。腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展受多種因素影響,其中環(huán)境因子就是一類重要的影響因素。研究建立體外腎小管細胞在環(huán)境因子作用下發(fā)生的形態(tài)學及生理生化等變化的檢測評價手段,對于研究腎臟疾病尤為重要。本論文以大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E為模式研究對象,分別用不同濃度的葡萄糖和結(jié)締組織生長因子(CTGF)與NRK-52E細胞進行共培養(yǎng),檢測它們對NRK-52E細胞生物活性的影響。利用原子力顯微鏡(AFM)力學檢測技術(shù),在單細胞水平檢測細胞形貌、高度、楊氏模量和粘附力的改變,并與生物學分析方法進行結(jié)合驗證。AFM檢測結(jié)果表明:葡萄糖(終濃度為5.5、10、25 mM)和CTGF(終濃度為0、2、10 ng/mL)刺激72 h后,細胞的形貌均由橢圓形逐漸變成長梭形,細胞高度增加、粘附力降低、楊氏模量增高,且都呈現(xiàn)劑量依賴性關系,當葡萄糖濃度達50 mM、CTGF濃度達50 ng/mL時細胞損傷嚴重,不再呈趨勢變化;免疫印跡試驗(Western Blot)檢測顯示E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達減少、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達增加,熒光標記顯示細胞骨架發(fā)生重排,MTT檢測細胞活力降低,且均與葡萄糖和CTGF濃度呈劑量依賴性關系。以上研究結(jié)果表明,葡萄糖或CTGF刺激均能使NRK-52E細胞發(fā)生損傷,降低細胞生物活性。本文利用AFM力學檢測技術(shù)和生物學檢測技術(shù)相結(jié)合的方法,鑒定不同環(huán)境因子對腎小管細胞生物活性的影響,側(cè)重于細胞骨架重排和鈣黏蛋白介導的細胞粘附研究,這些發(fā)現(xiàn)有助于為研究腎臟疾病提供新的研究思路。
【圖文】：

圖 1.1 （a）AFM 的原理示意圖，（b）力-掃描管位置變化曲線示意圖，實線代表趨近力曲線，虛線代表趨離力曲線，圖片來源于文獻[51]AFM 的工作模式主要有 3 種，分別為接觸模式（Contact mode）、非接觸模式（Non-contact mode）以及輕敲模式（Tapping mode），通常以探針針尖作用于待測樣品表面的作用力方式來進行劃分。本文實驗采用輕敲模式對細胞進行掃描成像，輕敲模式是介于接觸和非接觸模式之間的一種掃描模式。采用輕敲模式對樣品進行檢測時樣品與針尖的接觸是非常短暫的，它們之間因接觸而產(chǎn)生的作用力微小，對樣品的損傷也會較小[52]。與接觸模式相比較，輕敲模式不僅能擁有高的成像分辨率，而且能夠大大減小針尖對于待測樣品表面形貌的改變[53]；與非接觸模式相比，輕敲模式對起伏較大的樣品表面感知更敏感，進行掃描成像分辨率更高，因此測量較柔軟或黏性較大的樣品時可以優(yōu)先選擇輕敲模式[54]。在掃描過程中，保持 X-Y 平面不動，懸臂梁在待測樣品表面以共振頻率的方式振蕩，驅(qū)動探針針尖以速率的周期性短暫接觸樣品表面，并通過出來的光強差顯示在檢測器上來確定針尖在樣品上的振動幅度。針尖在未接觸樣品表面之前做自由振蕩，振蕩幅度較大，一旦針尖距離樣品表面達到作用力閾值，探針便只在 Z 方向上趨近、觸

德國 JPK 的 AFM，選用 MLCT 探針測量細胞的形貌和力學定 0.5-1 h，再開始進行細胞測量。穩(wěn)定儀器時在超凈臺中進行的死細胞和雜質(zhì)等洗掉，以防探針被污染導致測量數(shù)據(jù)不準要先使用連接在光學顯微鏡側(cè)端的 CCD 相機獲得細胞顯微胞圖像一般由放大 100 倍的鏡頭獲取圖像，如圖 2.1，使用 C設置由 JPK 的 CellHesion200 軟件驅(qū)動。將待測的細胞樣品壓電陶瓷，選擇液相模式，調(diào)試好激光位置后，通過力校準將探針移動到細胞核附近開始實驗，采用輕敲模式進行細胞的 256×256 像素點，圖像掃描最大范圍為 100×100 μm2，根掃描范圍。檢測細胞時應用 Hertz-Sneddon 模型，如圖 2.1 所探針，探針的彈性系數(shù)為 0.05 N/m，，實驗室溫度為 25℃，濕度為 3.10 V，測量細胞形貌時，模型掃描頻率為 0.3 Hz，測近和趨離速率為 1 μm/s，施加的力均為 0.6 nN，掃描速度均鏡和 AFM 裝置都設置在抗震臺上，所有的細胞信息均在相
【學位授予單位】：長春理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R692

【參考文獻】

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1 巫青;潘運龍;皮江;林賈穎;張利國;林唯棟;;順鉑誘導肝癌HepG2細胞凋亡的原子力顯微鏡研究[J];實用醫(yī)學雜志;2014年16期

2 陳豫閩;熊祖應;;轉(zhuǎn)化生長因子β1抑制人腎小管上皮細胞的增殖[J];中國組織工程研究;2013年07期

3 蔡小芳;蔡繼業(yè);董世松;鄧華;胡明鉛;;應用原子力顯微鏡分析正常淋巴細胞和Jurkat細胞的形態(tài)和機械性質(zhì)[J];生物工程學報;2009年07期

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1 王巖;基于拉曼光譜和AFM力學信息研究PM2.5對A549細胞的影響[D];長春理工大學;2018年

2 于小婷;姜黃素和碳點對SH-SY5Y細胞生物物理特性影響的研究[D];天津大學;2016年

本文編號：2632738