【摘要】：目的:炎癥反應(yīng)是急慢性腎損傷的共同特征,炎癥反應(yīng)持續(xù)存在會引起腎小管間質(zhì)纖維化的形成。NOD樣受體(Nod-like receptor,NLR)家族是固有免疫的重要成員,通過識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)激活下游炎癥信號通路,進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)。NLRP3是NLR家族中研究最為廣泛的成員,在PAMP或DMAP的刺激下活化,促進(jìn)下游炎癥因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放,加重組織炎癥和損傷。但是NLRP3炎性小體在腎損傷后炎癥反應(yīng)發(fā)生中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不十分清楚。本研究擬通過體內(nèi)、體外實驗,探討NLRP3炎性小體在急、慢性腎損傷后腎組織炎癥反應(yīng)中的作用,并探討其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法:1.在NLRP3炎性小體在缺血性急性腎損傷中的作用研究中,我們運(yùn)用成年雄性野生型或NLRP3敲除小鼠構(gòu)建腎臟缺血再灌注模型。分組后,分別夾閉腎蒂25分鐘或僅做開關(guān)腹處理。3天后處死小鼠并收集血、尿和組織標(biāo)本,檢測血尿指標(biāo)變化;PAS染色觀察腎組織病理改變;免疫組化染色觀察NLRP3蛋白的表達(dá)和分布;運(yùn)用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測腎組織中NLRP3炎性小體組分和炎癥因子的表達(dá)水平。體外實驗中,運(yùn)用不同時間的缺氧刺激HK-2細(xì)胞,觀察NLRP3炎性小體的表達(dá);激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá),線粒體來源ROS的表達(dá),線粒體膜電位的變化,以及NLRP3與線粒體的共定位情況;使用si RNA技術(shù)沉默TXNIP或NLRP3,觀察缺氧復(fù)氧損傷后HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的表達(dá);運(yùn)用線粒體特異性ROS清除劑Mito TEMPO干預(yù)HK-2細(xì)胞,觀察缺氧復(fù)氧損傷后HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的表達(dá)。2.在NLRP3炎性小體在Ang Ⅱ灌注誘導(dǎo)腎損傷的作用研究中,我們運(yùn)用成年雄性野生型、AT1R敲除或NLRP3敲除小鼠構(gòu)建Ang Ⅱ灌注損傷模型。28天后處死小鼠并收集血、尿和組織標(biāo)本,檢測血尿指標(biāo)變化;PAS染色觀察腎組織病理改變;免疫組化染色觀察NLRP3蛋白的表達(dá)和分布;運(yùn)用Real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測腎組織中NLRP3炎性小體組分和炎癥因子的表達(dá)水平。體外實驗中,運(yùn)用不同濃度的Ang Ⅱ刺激HK-2細(xì)胞,與不同時間點收集細(xì)胞,觀察NLRP3炎性小體的表達(dá);激光共聚焦顯微鏡檢測HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá),線粒體來源ROS的表達(dá),線粒體膜電位的變化,以及NLRP3與線粒體的共定位情況;使用si RNA技術(shù)沉默AT1R或NLRP3,觀察Ang Ⅱ刺激后HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的表達(dá);運(yùn)用線粒體特異性ROS清除劑Mito TEMPO干預(yù)HK-2細(xì)胞,觀察Ang Ⅱ刺激后HK-2細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的表達(dá)。3.運(yùn)用巨噬細(xì)胞特異性TNF敲除小鼠和T細(xì)胞特異性TNF敲除小鼠構(gòu)建Ang Ⅱ灌注模型,收集腎組織進(jìn)行Realtime PCR檢測,觀察TNF特異性敲除對腎組織內(nèi)NLRP3炎性小體活化的影響。結(jié)果:1.與對照組相比,缺血再灌注損傷組小鼠腎功能顯著下降,尿液NGAL表達(dá)升高,腎小管損傷顯著,管腔內(nèi)有大量管型生成,腎組織內(nèi)NLRP3炎性小體顯著激活。NLRP3敲除可減輕缺血再灌注損傷后的腎臟損傷,抑制腎組織內(nèi)NLRP3炎性小體的活化,減少下游炎癥因子的表達(dá)。2.體外實驗中,缺氧復(fù)氧損傷引起HK-2細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)增加,NLRP3炎性小體活化,線粒體膜電位下降和ROS生成增多。線粒體特異性ROS清除劑Mito TEMPO顯著減輕缺氧復(fù)氧損傷引起的線粒體功能障礙,抑制NLRP3炎性小體的活化。3.與對照組相比,Ang Ⅱ灌注野生型小鼠腎功能顯著下降,尿液NAG表達(dá)升高,腎小管管腔內(nèi)有管型生成,腎組織內(nèi)NLRP3炎性小體顯著激活。AT1R敲除或NLRP3敲除可減輕缺血再灌注損傷后的腎臟損傷。Mito TEMPO干預(yù)顯著減輕Ang Ⅱ灌注誘導(dǎo)的腎臟損傷,抑制腎組織內(nèi)NLRP3炎性小體的活化,減少下游炎癥因子的表達(dá)。4.體外實驗中,Ang Ⅱ刺激引起HK-2細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)增加,刺激NLRP3炎性小體活化,引起線粒體膜電位下降和ROS生成增多。AT1R沉默阻斷Ang Ⅱ刺激誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化,而AT2R沉默對NLRP3炎性小體活化無顯著影響。線粒體特異性ROS清除劑Mito TEMPO顯著減輕缺氧復(fù)氧損傷引起的線粒體功能障礙,抑制NLRP3炎性小體的活化。5.巨噬細(xì)胞特異性TNF敲除和T細(xì)胞特異性TNF敲除對Ang Ⅱ灌注引起的小鼠腎組織炎癥和NLRP3炎性小體活化無顯著影響。結(jié)論:急、慢性腎損傷中均存在小管上皮細(xì)胞損傷和腎臟炎癥反應(yīng)。該過程可能與NLRP3炎性小體活化有關(guān),而線粒體功能障礙可能是NLRP3炎性小體活化、進(jìn)而引起急慢性腎損傷的重要機(jī)制,此發(fā)現(xiàn)為急、慢性腎臟病的臨床防治提供了新的治療靶點和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R692

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本文編號：2630920