【摘要】：活性氧(reactive oxygen species,ROS)是在生物體內(nèi)氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的高活性含氧物質(zhì)的總稱,包括過(guò)氧化物、超氧化陰離子和羥自由基等,既是正常代謝的副產(chǎn)物,也可以在病理?xiàng)l件下產(chǎn)生,如腎缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷。正常情況下,ROS在細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,但是ROS的過(guò)度生成會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。例如在腎的I/R損傷中,ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激使腎近端小管細(xì)胞(proximal tubular cells,PTC)受損。自噬(Autophagy)在細(xì)胞損傷修復(fù)中扮演著重要角色,它是普遍存在于大部分真核細(xì)胞中的一種現(xiàn)象,可通過(guò)溶酶體介導(dǎo)降解細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白和受損的細(xì)胞器。自噬既是正常情況下維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要保守機(jī)制,也是一種細(xì)胞在外界壓力、饑餓、缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等特殊情況下的自我生存機(jī)制。自噬機(jī)制的受損與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝相關(guān)疾病、免疫性疾病等發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。大量證據(jù)表明,自噬與非選擇性陽(yáng)離子通道超家族TRP(transient receptor potential)有著密切聯(lián)系。經(jīng)典型瞬時(shí)受體電位通道6(transient receptor potential canonical6,TRPC6)是TRP中的一員,在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用。然而,在腎的近端小管細(xì)胞中,TRPC6與自噬的關(guān)系以及它們?cè)谀I氧化應(yīng)激損傷中的作用尚不清楚。本研究采用野生型(wild type,WT)小鼠和TRPC6基因敲除(TRPC6~(-/-))小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料及研究對(duì)象,利用腎小管體外貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)原代近端小管細(xì)胞,利用分子生物學(xué)方法探討了TRPC6在ROS導(dǎo)致的PTC自噬中的作用及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激觸發(fā)PTC中TRPC6依賴的Ca~(2+)內(nèi)流,進(jìn)而抑制自噬,使細(xì)胞更容易死亡。我們還證實(shí)TRPC6基因敲除(TRPC6~(-/-))或利用SAR7334抑制TRPC6均可增強(qiáng)自噬流,減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的PTC凋亡。TRPC6敲除的保護(hù)性作用可以被自噬抑制劑氯喹(Chloroquine,CQ)和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,BAF)所阻止。此外,本研究還表明,阻斷TRPC6可以通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR和ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)自噬流。本研究首次證明TRPC6介導(dǎo)的Ca~(2+)內(nèi)流在抑制PTC氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)性自噬中具有重要作用,TRPC6可能成為未來(lái)防治腎氧化應(yīng)激損傷的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文研究結(jié)果1. TRPC6 參與 ROS 介導(dǎo)的鈣內(nèi)流1.1 ROS 促進(jìn)腎近端小管細(xì)胞中 TRPC6 蛋白表達(dá)腎近端小管細(xì)胞主要表達(dá) TRPC3 和 TRPC6 兩種亞型，它們?cè)诙喾N病理過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用，，為了觀察 ROS 對(duì)這兩種亞型的影響，我們用不同濃度的 H2O2（圖 1A）或叔丁基過(guò)氧化氫（tert-butyl hydroperoxide, t-BOOH）（圖 1B）刺激原代培養(yǎng)的腎近端小管細(xì)胞（proximaltublarcell,PTC）12h，用免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot 法）檢測(cè) TRPC3 和TRPC6 在 PTC 中的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激增強(qiáng)了腎近端小管細(xì)胞中 TRPC6 的表達(dá)，對(duì) TRPC3 表達(dá)的影響不明顯。在后面的研究中，我們主要研究TRPC6。

圖 2. TRPC6 參與 ROS 介導(dǎo)的 SOCEA 示 H2O2處理增加 PTC 中 Tg 誘導(dǎo)的 SOCE，增加鈣離子內(nèi)流。B 示原代 PTC 中，TRPC6 抑制劑SAR7334 可抑制 H2O2介導(dǎo)的 SOCE。C 示 TRPC6 基因敲除小鼠原代 PTC 中，TRPC6 表達(dá)較 WTPTC 顯著降低，Bar=20μm。D 示 TRPC6-/-PTC 中，H2O2激活的 SOCE 被抑制。柱狀圖示 SAR7334及 TRPC6-/-導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi) SOCE 介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子峰值的改變，顯示對(duì)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以 P 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用星號(hào)（*）表示。1.3 TRPC6 參與 ROS 介導(dǎo)的 ROCE為了驗(yàn)證 TRPC6 是否具有類似 ROC 樣的作用，我們使用了 TRPC6 的激活劑 OAG（1-oleoyl-2-acetyl-glycerol ，OAG），并檢測(cè)受體門控性鈣內(nèi)流 ROCE（receptoroperatedcalciumentry，ROCE）。正常情況下，HK-2 細(xì)胞中 TRPC6 表達(dá)水平極低，H2O2不能引起細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，在 H2O2處理同時(shí)應(yīng)用 TRPC6 激活劑 OAG 僅可引起微弱的鈣離子
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R692

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本文編號(hào)：2627365