【摘要】：研究背景膀胱尿路上皮癌(urothelial bladder cancer,UBC)又稱為膀胱移行細胞癌,是一種十分常見的惡性腫瘤,對公眾健康有著重要的影響。在全世界范圍內(nèi),UBCs的發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的第七位,女性惡性腫瘤的第十七位。其中,非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)為UBCs中最常見的類型,大約有75%新診斷的UBC為NMIBC。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是治療NMIBC的金標準,但是高達70%的NMIBC患者經(jīng)TURBT治療后會復發(fā)。非肌層浸潤性膀胱癌已經(jīng)成為實體腫瘤中復發(fā)率最高的腫瘤。因其超高的復發(fā)率,NMIBC亦已成為治療費用最昂貴的腫瘤之一。NMIBC的復發(fā)可能與膀胱局部非常隱蔽的微小轉(zhuǎn)移灶有關,但是由于膀胱局部血供有限,常規(guī)的靜脈化療給藥只有一小部分藥物能夠最終到達膀胱腫瘤局部,效果不佳且有較大的全身副作用。因此,NMIBC患者TURBT術后應行膀胱灌注,即化療藥物通過導管直接注入膀胱,以獲得較高的局部濃度和較小的全身副作用。傳統(tǒng)膀胱灌注的局限性主要是灌注的化療藥物濃度難以維持,以及在膀胱內(nèi)的滯留時間有限;膀胱灌注的化療藥物隨時間被尿液稀釋,并在排尿時由尿道排出。因此,提高膀胱灌注的化療藥物作用時間是一項改善NMIBC臨床預后和降低治療經(jīng)濟負擔的重要研究課題,本研究旨在開發(fā)一種新型膀胱灌注系統(tǒng)來實現(xiàn)化療藥物在膀胱內(nèi)的持續(xù)起效。碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)因其超高的比表面積,較高的熱穩(wěn)定性和化學惰性,且其碳原子sP2雜化方式易通過π-π吸附作用與部分有相似結(jié)構(gòu)的化療藥物相結(jié)合,己被研究用于化療藥物的載藥和傳送。碳納米管分為單壁碳納米管(singlewalled carbon nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotubes,MWCNTs)。MWCNTs的生物毒性低于SWCNTs,被強酸處理后的羧基化多壁碳納米管(carboxylated multiwalled carbon nanotubes,mMWCNTs,MWCNTs-COOH)不僅減輕了碳納米管的毒性,而且提高了碳納米管在水溶液中的分散性。本研究初步設計使用MWCNTs-COOH負載化療藥物用于膀胱灌注。然而,MWCNTs-COOH本身并不能延長化療藥物在膀胱內(nèi)的滯留時間。近些年來,磁性納米顆粒由于其固有的納米材料特性、具有良好的超順磁性能,以及其在癌癥診斷和治療中的巨大潛力而備受關注。本課題組之前的研究表明,包括四氧化三鐵(Ferrosoferric oxide,Fe3O4)磁性納米顆粒在內(nèi)的溫敏凝膠系統(tǒng),在外加磁場的作用下可以延長化療藥物在膀胱內(nèi)的滯留時間。然而,溫敏凝膠系統(tǒng)對NMIBC患者的膀胱灌注治療作用有限:首先,溫敏凝膠體系中的大多數(shù)藥物被交聯(lián)的松散結(jié)構(gòu)分散開,使化療藥物與膀胱粘膜分離;其次,溫敏凝膠可能由于自身的膨脹作用而阻塞膀胱輸尿管口;第三,溫敏凝膠體系的溫度依賴性制備方法限制了其臨床應用。因此,本研究引入磁性Fe304納米顆粒修飾羧基化的多壁碳納米管,創(chuàng)新性的制備了一種基于磁性羧基化多壁碳納米管(magnetic carboxylated multiwalled carbon nanotubes,mMWCNTs)的膀胱內(nèi)灌注載藥系統(tǒng),在外加磁場的作用下,mMWCNTs能夠顯著延長其負載藥物的膀胱內(nèi)滯留時間。膀胱癌最常用的膀胱灌注化療藥物包括吡柔比星、表柔比星(epirubicin,EPI)、多柔比星、羥喜樹堿、絲裂霉素和吉西他濱等。對于NMIBBC患者,TURBT術后早期灌注EPI是一種安全有效的方法。EPI是一種蒽環(huán)類細胞抑制劑,是多柔比星的異構(gòu)體。與多柔比星相比,EPI具有更低的心臟和血液毒性。多壁碳納米管表面可以通過π-π吸附作用有效負載EPI。并且,因為其超高的比表面積和表面功能基團的作用,mMWCNTs負載EPI的能力優(yōu)于MWCNTs。因此,本研究提出了一種基于mMWCNTs的膀胱灌注緩釋系統(tǒng):mMWCNTs負載EPI形成磁性竣基化多壁碳納米管表柔比星復合物(magnetic carboxylated multiwalled carbon nanotubes-epirubicin,mMWCNTs-EPI),成功解決了上文提到的問題。研究目的本研究的目的是報道一種用于膀胱內(nèi)灌注的mMWCNTs-EPI藥物緩釋系統(tǒng),以取代目前的膀胱灌注方式。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)由羧基化多壁碳納米管、Fe3O4磁性納米顆粒和蒽環(huán)細胞抑制劑表柔比星組成。本研究首先構(gòu)建了mMWCNTs載藥系統(tǒng),并檢測了其形貌、磁響應性、功能基團及各項理化性質(zhì);并于體外體內(nèi)實驗中檢測了mMWCNTs載體的生物安全性以及其在體內(nèi)的滯留效應。在外加磁場的作用下,檢測了mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)持續(xù)釋放EPI的能力。并通過體外和體內(nèi)實驗,檢測與單純應用EPI相比,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)對膀胱癌的抑制作用及其機制。實驗方法磁性多壁碳納米管(mMWCNTs)的制備本研究使用混酸將催化化學氣相沉積法制備的MWCNTs羧基化,形成MWCNTs-COOH。然后用共沉淀法將Fe3O4附著于MWCNTs-COOH表面,形成mMWCNTs。首先,750 mg MWCNTs經(jīng)80 kHz超聲振動30 min,分散于300 mL的混酸溶液中(硫酸:硝酸=1:3)。然后將混懸液加熱到95°C維持4 h,MWCNTs在混酸的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镸WCNTs-COOH。MWCNTs-COOH在鼓風干燥箱中干燥后,將100 mg干燥的MWCNTs-COOH樣品超聲分散于雙蒸水中,并加入42.8 mg FeC1l24H20和116.8 mg FeC13·6H2O(Fe2+:Fe3+的摩爾比為1:2)。干燥的MWCNTs-COOH與預計反應生成的Fe304的質(zhì)量比為2:1。反應體系通氬氣0.5 h,去處體系中的氧氣。然后將反應體系加熱到60°C,并加入適量氨水。反應體系在60°C保持2 h,然后加熱到90°C,保持0.5 h,生成終產(chǎn)物mMWCNTs。mMWCNTs用雙蒸水清洗數(shù)遍并于鼓風干燥箱中干燥。干燥后的mMWCNTs置于超凈工作臺中,用紫外輻射法殺菌。mMWCNTs形貌及理化性質(zhì)的表征mMWCNTs的透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)圖像由JEM-1011透射電子顯微鏡采集,加速電壓為60 kV。場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy,FESEM)圖像由日立SU-70掃描電子顯微鏡系統(tǒng)在30-100 kV加速電壓下采集。干燥后的mMWCNTs固定在碳膠帶上,用離子鍍金機鍍上一層金后進行FESEM掃描。mMWCNTs的Zeta電勢通過Delsa?納米C粒子分析儀獲得。mMWCNTs的傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)經(jīng)ALPHA傅里葉變換紅外分光計測定。波長范圍為4000～400 cm-1,分辨率為4 cnr1。采用X'Pert3粉末衍射儀采集mMWCNTs的X射線衍射(X-ray-diffraction,XRD)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。采用MicroMagT?Model 2900交變梯度磁強計(alternating gradient force magnetometer,AGM),檢測mMWCNTs的磁響應性。用2 mg/mL的mMWCNTs混懸液外加磁場觀測mMWCNTs的宏觀磁性。細胞培養(yǎng)T24細胞在添加10%胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)的McCoy'5A培養(yǎng)基中培養(yǎng);5637細胞在添加10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的細胞均在37°C,5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并于對數(shù)生長期獲取細胞進行實驗。細胞活力測定采用CCK-8法檢測mMWCNTs對細胞活力的影響。5637和T24細胞分別以每孔5×103個細胞的密度種于96孔板中。細胞貼壁后,將mMWCNTs以0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μg/mL的終濃度分別刺激5637和T24細胞,每組設三個復孔,并設立空白對照組。72h后按照說明書向96孔板中加入CCK-8溶液,孵育4h后用酶標儀在450 nm波長處測定光密度值。將結(jié)果繪制柱狀圖。采用CCK-8法檢測mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)對5637和T24細胞的殺傷作用。以上述細胞密度分別將5637和T24細胞種于96孔板中。第1組為對照組。第2～4組為實驗組,按照下述方法加刺激:第2組,40 μg/mL的mMWCNTs混懸液并外加磁場;第3組,終濃度為2 μg/mL的EPI溶液;第4組,mMWCNTs-EPI混懸液(EPI的終濃度為2 μg/mL)并外加磁場。分別在第2、4、6、8、10、12、24 h對所有組更換培養(yǎng)基以模擬正常排尿規(guī)律。按照說明書向96孔板中加入CCK-8溶液,孵育4 h后用酶標儀在450 nm波長處測定光密度值。將實驗結(jié)果繪制柱狀圖。細胞形態(tài)學測定為了觀察mMWCNTs對細胞F-肌動蛋白骨架排列及細胞形態(tài)的影響,本課題將培養(yǎng)的細胞進行熒光素異硫氰酸酯標記的鬼筆環(huán)肽(fluorescein isothiocyanate-phalloidin,FITC-phalloidin)染色。5637和T24細胞分別分為對照組和實驗組。實驗組用終濃度為40 μg/mL的mMWCNTs混懸液處理72 h。對照組以等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)處理72 h。處理結(jié)束后用冷甲醇固定細胞10 min,FITC-phalloidin染色1h,并用DAPI復染細胞核。熒光顯微鏡拍照。體內(nèi)實驗檢測mMWCNTs的生物安全性用12只雌性Wistar大鼠測定mMWCNTs的生物安全性。6只大鼠作為實驗組,通過自制裝置將3200高斯(Gauss,G)磁鐵分別固定于實驗組大鼠膀胱附近,每3天膀胱灌注一次mMWCNTs(2.5 mg/1 mL),持續(xù)1個月,另外6只正常飼養(yǎng)的大鼠作為對照組。1個月后靜脈分別采集兩組大鼠血液樣本進行血清生化檢測,離心分離法(3000轉(zhuǎn)/minx100min)從血液中提取血清樣本,采用全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、血肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)等生化指標。解剖并獲取兩組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和大腦等器官,4%多聚甲醛固定,脫水,石蠟包埋,切片染色以檢測mMWCNTs的全身毒性。EPI的吸附和釋放實驗將EPI以1 mg/mL的濃度溶解于雙蒸水中。將相同質(zhì)量的mMWCNTs超聲30 min,振蕩混合入EPI溶液中,EPI被吸附于mMWCNTs表面制備成mMWCNTs-EPI混懸液。然后將mMWNTs-EPI混懸液靜置于磁力架上,101m/min后,在外部磁場的作用下,mMWCNTs-EPI牢牢地吸附于管壁上,而未被mMWCNTs磁性載體吸附的EPI則游離于溶液中。吸取游離的EPI以高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定EPI濃度并計算EPI吸附率。EPI吸附率計算公式如下:吸附率=(總EPI質(zhì)量-游離EPI質(zhì)量)/(EPI總質(zhì)量)x100%然后將制備的mMWCNTs-EPI分別分散于pH=4、6或8的PBS中,置于搖床上。每隔2 h,將混懸液重新置于磁力架上,在外加磁場的作用下將釋放的EPI溶液全部收集,并重新加入pH=4、6或8的PBS溶液(模擬正常排尿規(guī)律)。根據(jù)EPI的濃度變化確定mMWCNTs-EPI釋放EPI的比率,并計算藥-時曲線下面積(areas under the concentration-time curves,AUC)。mMWCNTs-EPI的體內(nèi)滯留實驗在3200 G的外加磁場作用下,對大鼠膀胱內(nèi)mMWCNTs-EPI的滯留時間進行測定。用mMWCNTs-EPI分別灌注15只雌性Wistar大鼠,并在灌注后第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h等5個時間點處死大鼠,每個時間點處死3只。解剖獲取15只大鼠的膀胱組織,并用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,按照4 pm厚度切片。進行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE)染色,觀察mMWCNTs-EPI的體內(nèi)滯留情況。體外實驗定置檢測細胞凋亡為了定量測定細胞凋亡狀態(tài),5637和T24細胞被分別種到6孔板中,細胞的密度均為每孔1×105個細胞。第1組為對照組。第2～4組為實驗組,按照下述方法處理24h:第2組,終濃度為40 pg/mL的mMWCNTs混懸液并外加磁場;第3組,終濃度為2pg/mL的EPI溶液;第4組,mMWCNTs-EPI混懸液(EPI的終濃度為2μpg/mL)并外加磁場。分別在第2、4、6、8、10、12、24 h對所有組更換培養(yǎng)基以模擬正常排尿規(guī)律。收集細胞,并使用FITC annexin V凋亡檢測試劑盒對細胞進行annexin V和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色。然后采用FACSDiva流式細胞儀檢測凋亡細胞。體外實驗定置檢測細胞增殖情況為檢測mMWCNTs對膀胱腫瘤細胞增殖情況的影響,5637和T24細胞被分別種到24孔板中,細胞的密度均5x104個細胞每孔。按照“細胞形態(tài)學測定”和“體外實驗定量檢測細胞凋亡”兩個實驗中的分組分別處理細胞。處理結(jié)束后,實驗組和對照組均用EdU處理2h,然后室溫下用Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Imaging試劑盒孵育顯像,用DAPI復染細胞核。用熒光顯微鏡采集圖像,然后利用Image J軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗結(jié)果用EdU陽性細胞核與總細胞核之比表示。每個切片拍攝三個高倍鏡視野,實驗重復三次。化學方法誘導Wistar大鼠膀胱腫瘤模型本課題根據(jù)文獻,采用N-甲基亞硝基脲(N-methy1-N-nitrosourea,MNU)誘導大鼠膀胱腫瘤模型。首先,雌性Wistar大鼠腹腔注射3%戊巴比妥(30 mg/kg)進行麻醉。然后,用自制截短的3F硬膜外麻醉導管將膀胱內(nèi)尿液引流干凈,在膀胱內(nèi)灌注MNU(MNU需要在灌注前45 min內(nèi)配制)。每隔一周進行一次MNU膀胱灌注,共4次(8周)。體內(nèi)實驗檢測mMWCNTs-EPI抗腫瘤活性本研究使用30只雌性Wistair大鼠進行實驗。30只大鼠隨機分為5組。第1組為對照組,給予正常飲食。第2～5組為實驗組,實驗組大鼠均采用上述化學方法誘導膀胱腫瘤模型。8周后第2～5組Wistar大鼠分別按照下述方法進行膀胱灌注:第2組,0.1 mL PBS溶液;第3組,0.25 mg/0.1 mL mMWCNTs混懸液并外加磁場;第4組,0.1 mg/0.1 mL EPI溶液;第5組,0.1 mL mMWCNTs-EPI混懸液(含0.1 mg EPI,0.25 mg mlMWCNTs)并外加磁場。第2～5組Wistar大鼠每周接受1次膀胱灌注,持續(xù)6周。所有大鼠在實驗結(jié)束后均予以安樂死并進行尸檢(第3組1只Wistar大鼠死于麻醉意外)。解剖獲取各組大鼠的膀胱、輸尿管和腎臟。記錄每只大鼠腫瘤總體積及每個腫瘤體積。直徑0.5 mm的病變定義為腫瘤。腫瘤體積計算按照以下方程計算:V(mm3)=1/2x長x寬。免疫組織化學染色各組膀胱在4%多聚甲醛中固定至少24h,脫水、石蠟包埋、切片,并進行Bc1-2、Bax、Cleaved caspase-3免疫組織化學染色和Ki67免疫熒光染色。陰性對照不加一抗。利用Image-Pro Plus 6.0進行免疫組化圖像分析,利用平均光密度值計算Bc1-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達量。采用Image J軟件分析Ki67陽性細胞比率。統(tǒng)計學分析本研究中所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 20.0軟件進行。連續(xù)變量數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。各組間的差異通過單因素方差分析來比較。組間的多重比較采用Tukey's檢驗來分析。P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果mMWCNTs形貌及理化性質(zhì)的表征本研究通過TEM和FESEM表征了mMWCNTs的形貌。原始MWCNTs的長度是10～30 μm;經(jīng)過強酸處理后,MWCNTs-COOH的長度被剪切為200～1000 nm。近距離觀察發(fā)現(xiàn),MWCNTs-COOH表面緊緊包被納米Fe3O4。mMWCNTs懸浮液的Zeta電勢為-47.31±0.16 mV,證明其有良好的水溶液穩(wěn)定性。MWCNTs-COOH和mMWCNT的FTIR光譜在3434 cnr1,1626 cm-1,1384 cm-1和1045 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別為O-H鍵,C=O基團,C-OH鍵和C-O鍵的振動峰,說明經(jīng)強酸處理后,在多壁碳納米管的表面產(chǎn)生了-COOH和-OH等功能基團。此外,mMWCNTs在582 cm-1處的吸收峰為金屬-氧鍵,說明mMWCNTs樣品表面成功負載了磁性Fe3O4納米粒子。X射線衍射進一步證實了mMWCNT中金屬-氧鍵的結(jié)構(gòu)。根據(jù)JCPDS文件(No.190629),mMWCNTs在20=30.16°,35.58°,43.22°°°,53.70°,57.22°和62.87°的六個衍射峰分別為立方Fe304的(220),(311),(400),(422),(511)和(440)晶面特征峰。此外,mMWCNTs在20二26.02°處的衍射峰為碳納米管石墨片層的(002)晶面特征峰,此峰并非最明顯,這表明mMWCNTs被Fe3O4納米顆粒包裹。本研究采用AGM測定了mMWCNTs的磁滯曲線。結(jié)果顯示mMWCNTs具有超順磁性,最大飽和磁化強度為19.13 emu/g。殘余磁化率和矯頑力均為零,磁滯曲線呈可逆的S形,樣品中無遲滯現(xiàn)象。用2 mg/mL的mMWCNTs混懸液觀測mMWCNTs的宏觀磁性。當外加磁場時,mMWCNTs從混懸液中分離,并迅速被磁鐵吸引,混懸液變澄清。當mMWCNTs輕微搖晃后又重新回到懸浮狀態(tài)。mMWCNTs混懸液靜置15天后僅觀察到微量mMWCNTs沉積物,表明mMWCNTs在水溶液中的穩(wěn)定性良好。mMWCNTs的生物安全性檢測本研究采用CCK-8實驗檢測mMWCNTs的細胞毒性,終濃度為0.625～40μg/mL的mMWCNTs處理72 h后,均未檢測到mMWCNTs對5637和T24細胞的毒性。本研究通過鬼筆環(huán)肽染色,觀察mMWCNTs對細胞F-肌動蛋白骨架排列及細胞形態(tài)的影響。結(jié)果顯示,F-肌動蛋白染色主要見于細胞外膜,胞體內(nèi)亦有少量應力纖維。本研究發(fā)現(xiàn),F-肌動蛋白纖維在有絲分裂的所有時期均有所增加。對照組以及實驗組40 μg/mL mMWCNTs處理72 h之后,5637和T24細胞均未見明顯形態(tài)改變或F-肌動蛋白細胞骨架重塑。本研究通過計算EdU標記的陽性細胞比率,檢測mMWCNTs對細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,實驗組5637和T24細胞經(jīng)終濃度為40 μg/mL的mMWCNTs刺激72 h后,與對照組相比,EdU標記的陽性細胞比率沒有明顯改變。結(jié)果證實,mMWCNTs對細胞增殖沒有明顯影響。本研究用12只雌性Wistar大鼠測定了mMWCNTs的體內(nèi)毒性。結(jié)果顯示,mMWCNTs并無致死性或全身血生化毒性。在主要臟器中未發(fā)現(xiàn)mMWCNTs的聚集或任何可見的毒性征象(如炎癥細胞聚集、滲出或其他組織病理學改變)。12只大鼠均未出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、厭食、嗜睡等異常行為改變,實驗組和對照組大鼠的體重變化無明顯差異。EPI的緩釋作用及在大鼠膀觥內(nèi)的滯留效應HPLC結(jié)果顯示,單位質(zhì)量mMWCNTs的EPI吸附率為40.4%±9.6%。mMWCNTs-EPI緩慢釋放EPI,與單純應用EPI相比,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)釋放EPI的濃度下降較溫和,釋放EPI持續(xù)時間明顯長于EPI組。mMWCNTs-EPI持續(xù)釋放EPI使其AUC增加近兩倍。在外加磁場的作用下,Wistar大鼠膀胱灌注mMWCNTs-EPI 12 h后,mMWCNTs-EPI仍能穩(wěn)定存留于大鼠膀胱內(nèi)。隨著時間的推移,mMWCNTs-EPI的量和mMWCNTs-EPI覆蓋膀胱尿路上皮的面積逐漸減少。膀胱灌注96 h后,mMWCNTs-EPI在大鼠膀胱內(nèi)仍有少量殘余。mMWCNTs-EPI的體外抗腫瘤效應CCK-8結(jié)果顯示,模擬排尿規(guī)律,在第2、4、6、8、10、12、24 h更換培養(yǎng)基的條件下,mMWCNTs-EIPI緩釋系統(tǒng)對5637和T24膀胱腫瘤細胞細胞活力的影響均大于單純應用EPI。流式細胞術結(jié)果顯示,在第2、4、6、8、10、12、24 h更換培養(yǎng)基的條件下,單純應用EPI組和mMWCNTs-EPI組5637細胞和T24細胞的凋亡率高于對照組和mMWCNTs組。與單純應用EPI組相比,mMWCNTs-EPI組細胞凋亡率明顯升高。EdU染色結(jié)果顯示,在第2、4、6、8、10、12、24h更換培養(yǎng)基的條件下,與單純應用EPI組相比,mMWCNTs-EPI組5637細胞和T24細胞的EdU標記細胞比率均明顯降低。統(tǒng)計分析顯示,mMWCNTs-EPI組細胞增殖率顯著低于單純應用EPI組,差異具有統(tǒng)計學意義。mMWCNTs-EPI的體內(nèi)抗腫瘤效應本課題通過向大鼠膀胱腫瘤模型分別膀胱灌注PBS、mMWCNTs、EPI和mMWCNTs-EPI,研究不同處理對膀骯腫瘤的抑制作用。無論評價標準是每只大鼠的總腫瘤體積還是每個腫瘤的體積,PBS灌注組和mMWCNTs灌注組對膀胱腫瘤生長的抑制作用均沒有顯著差異。mMWCNTs-EPI灌注組對腫瘤的抑制效果優(yōu)于單純灌注EPI組。PBS組和mMWCNTs組均出現(xiàn)1例單側(cè)腎積水;PBS灌注組出現(xiàn)1例雙側(cè)腎積水。腎積水是腫瘤浸潤膀胱輸尿管口或累及輸尿管所致。mMWCNTs-EPI促進細胞凋亡免疫組化結(jié)果顯示,相比于對照組,PBS灌注組和mMWCNTs灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達量降低,而Bc1-2的表達量升高;相比于PBS灌注組,EPI灌注組和mMWCNTs-EPI灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達量升高,而Bc1-2的表達量降低。本研究的實驗結(jié)果亦顯示,mMWCNTs-EPI灌注組的Bax和Cleaved caspase-3的表達量高于EPI灌注組,而Bc1-2的表達量低于EPI灌注組,差異具有統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果提示mMWCNTs-EPI灌注組相比于單純灌注EPI組,具有更強的誘導膀胱腫瘤線粒體依賴性細胞凋亡的作用。mMWCNTs-EPI抑制細胞增殖免疫熒光結(jié)果顯示,對照組Ki67陽性細胞比率很低,而在PBS組和mMWCNTs組,Ki67陽性細胞比率明顯升高。采用單純EPI或mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)膀胱灌注治療后,Ki67陽性細胞比率明顯降低,且mMWCNTs-EPI灌注組對Ki67表達的抑制作用強于EPI組。本研究結(jié)果提示mMWCNTs-EPI灌注組相比于單純灌注EPI組,具有更強的抑制腫瘤細胞增殖的作用。實驗結(jié)論本研究成功構(gòu)建了一種安全的基于磁性多壁碳納米管的膀胱灌注載藥系統(tǒng)。此系統(tǒng)負載化療藥物EPI后,形成的mMWCNTs-EPI載藥系統(tǒng)能夠緩釋EPI。在外加磁場的作用下,mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)有效延長了EPI在膀胱內(nèi)的滯留時間。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)增強了EPI的細胞毒性,促進了膀胱腫瘤線粒體依賴性細胞凋亡,抑制了膀胱腫瘤細胞增殖。mMWCNTs-EPI緩釋系統(tǒng)可以利用磁性緩釋和化療的協(xié)同作用,增強膀胱腫瘤的治療效果。
【圖文】：

圖１－１羧基化的小分子碳納米管（ＭＷＣＮＴｓ－ＣＯＯＨ）的制備逡逑

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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.14

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