【摘要】：腎結(jié)石是一種由環(huán)境飲食因素和遺傳因素引起的復雜疾病,以腎小管或腎間質(zhì)的晶體異常沉積為特征,臨床常表現(xiàn)為腎臟功能受損和尿路阻塞,發(fā)病率超過6-12%,五年再發(fā)率達50%,并可終生多次再發(fā)。腎結(jié)石的形成機制復雜,至今對其分子形成機制仍不清楚,導致目前臨床缺乏有效的治療和預防措施,而多以碎石、手術等方式暫時緩解病癥,不能在腎臟鈣化的發(fā)病機制上對結(jié)石形成進行有效的藥物抑制和再發(fā)預防。腎臟在維持和調(diào)節(jié)人體水、鹽均衡,排除代謝廢物的同時,易在腎小管形成鹽的過飽和狀態(tài),在常見的代謝異常如高草酸尿、高鈣尿的風險環(huán)境下,結(jié)晶沉積在腎小管或腎間質(zhì),導致腎臟鈣化,結(jié)晶不斷成核、聚集和生長,最終形成腎結(jié)石。在這個過程中,腎臟通過主動或被動的生物學行為表達和分泌一些大分子蛋白參與和影響結(jié)石形成。基質(zhì)谷氨酸蛋白(Matrix Gla protein,MGP)是一種維生素K依賴性的分泌蛋白,研究表明MGP與血管鈣化有關,是血管鈣化的抑制劑。我們研究組先前研究發(fā)現(xiàn),高草酸大鼠腎臟中在MGP蛋白表達的部位沒有結(jié)晶出現(xiàn),提示MGP可能也與腎結(jié)石的發(fā)病或病理過程相關,但具體分子機制不明。本研究擬分別在細胞和動物水平,通過調(diào)控MGP基因的表達量或者改變MGP蛋白的活性來闡明MGP蛋白對草酸鈣結(jié)石形成及其對細胞損傷的影響,以探索MGP在腎結(jié)石形成中的具體作用機制。首先,我們研究了MGP基因表達改變在草酸鈣結(jié)晶誘導腎小管上皮細胞損傷中的影響,我們構(gòu)建了表達靶向MGP基因的小干擾RNA序列的重組腺病毒(Ad-siMGP),以及過表達MGP基因的重組腺病毒(Ad-MGP)。我們用這兩種腺病毒分別感染腎小管上皮HK-2細胞,同時分別設定對照組,以研究改變細胞內(nèi)MGP基因的表達對草酸鈣結(jié)晶形成的影響。實時熒光定量PCR實驗的結(jié)果表明,Ad-MGP和Ad-siMGP分別轉(zhuǎn)染HK-2細胞48 h后,顯著升高或者降低了MGP mRNA的水平。我們初步實驗的原子吸收光譜檢測結(jié)果表明,Ad-MGP所誘導的MGP基因高表達顯著降低了草酸鈣結(jié)晶與HK-2細胞之間的黏著力。暗示MGP基因的上調(diào)可以通過減弱細胞黏著力從而減輕結(jié)晶對細胞的黏著而發(fā)揮腎小管上皮細胞的保護作用。其次,我們利用草酸鈣結(jié)晶刺激HK-2,研究了MGP蛋白的活性變化對結(jié)晶形成及對HK-2細胞損傷和凋亡的影響。有研究證實,維生素K1能顯著提升MGP蛋白活性,華法令則可以通過抑制維生素K1的合成發(fā)揮抑制MGP活性的作用,因此本研究中分別利用維生素K1和華法令上調(diào)或者下調(diào)MGP蛋白的活性,以草酸鈣結(jié)晶聯(lián)合維生素K1及華法令刺激HK-2,分別用MTT法及DAPI染色法檢測MGP蛋白活性變化對細胞損傷及凋亡的影響。結(jié)果表明,在草酸鈣結(jié)晶誘導了HK-2細胞損傷及凋亡的情況下,華法令的使用加重了結(jié)晶對細胞損傷及凋亡作用,而維生素K1與華法令的聯(lián)合添加則緩和了華法令的作用。這一結(jié)果暗示,MGP在草酸鈣結(jié)晶誘導的細胞損傷及凋亡中發(fā)揮細胞保護作用。我們進一步利用原子吸收光譜法檢測草酸鈣結(jié)晶對細胞黏著的影響,結(jié)果表明維生素K1添加的細胞顯示出顯著的細胞黏著力的下降,暗示MGP蛋白的活化可以通過減弱細胞黏著力從而減輕結(jié)晶對細胞的黏著而發(fā)揮腎小管上皮細胞的保護作用。而Ad-siMGP誘導的MGP基因的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了維生素K1對結(jié)晶所致HK-2細胞引起的細胞粘著力的下降。這一結(jié)果證明維生素K1對腎小管上皮細胞抵抗草酸鈣結(jié)晶的保護作用是通過增強MGP的活性實現(xiàn)的。最后,我們研究了動物水平上MGP參與腎結(jié)晶形成過程的可能影響。實驗所用的大鼠隨機分為三組,分別為空白對照組(-)、模型對照組(Normal saline組,注射生理鹽水的草酸鈣腎結(jié)石模型對照組)以及維生素K1組(Vitamin K1組,注射維生素K1的草酸鈣腎結(jié)石模型組)。免疫組織化學聯(lián)合偏光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,與空白對照組相比,模型對照組大鼠腎臟出現(xiàn)明顯的結(jié)晶,證明乙二醇導致腎結(jié)石模型造模成功。與模型對照組相比,維生素K1組大鼠腎臟組織的結(jié)晶明顯變小,且數(shù)量顯著減少,證明維生素K1的添加減輕了草酸鈣結(jié)晶的形成。這一結(jié)果也提示,維生素K1的補充可以成為臨床防治腎結(jié)石形成的新思路。綜上所述,本實驗在細胞和動物水平通過改變MGP基因表達量及MGP蛋白活性初步研究了MGP蛋白對草酸鈣結(jié)石形成的影響,證明了MGP基因表達量的上調(diào)和MGP蛋白活性的增強可以使HK-2細胞與草酸鈣結(jié)晶之間的黏著力顯著下降;同時,改變MGP蛋白活性可以改變結(jié)晶導致腎小管上皮細胞的損傷及凋亡作用;維生素K1顯著降低了大鼠腎臟草酸鈣結(jié)晶的形成。這些結(jié)果證明,MGP蛋白可以通過降低結(jié)晶與細胞黏著發(fā)揮抑制腎結(jié)石形成和保護腎上皮細胞免于損傷的作用。我們的結(jié)果豐富了腎結(jié)石形成的理論,為深入研究腎結(jié)石形成的分子機制奠定了堅實的基礎,并且為臨床腎結(jié)石的防治策略提供了新的思路。
【圖文】：

引 言的應用從側(cè)面證實了維生素 K 在血管鈣化中的作用。1998 年 Price 實驗室研究了華法令對軟組織鈣化的影響：香豆素衍生物是大鼠毒素的主要成分導致大鼠出血死亡，為了防止這一點，同時向大鼠施用華法令和維生素 K樣可以施用高劑量的華法林以防止軟組織中的 γ-羧化影響凝血。他們發(fā)現(xiàn)令能引起主動脈彈性薄片的快速鈣化，類似于 MGP 缺陷小鼠的表型[50]。素 K 首次以鈣化抑制劑身份與 MGP 聯(lián)系到一起[50]。不同于 Price 對大鼠超生理劑量的華法令，McCabe 等人檢測了治療劑量的華法令對未患有腎大鼠的影響：組織中有維生素 K 缺陷，但華法令并沒有誘導健康大鼠血管化，相比之下，，華法令在慢性腎臟病存在時會顯著增加血管鈣化水平[51]。綜上所述，維生素 K 和華法令在進行 MGP 參與血管鈣化的研究中被做GP 的激動劑和抑制劑而廣為使用。

第 1 章 MGP 基因表達改變對腎結(jié)石形成的影響商品化腺病毒 MGP 干擾載體（Ad-siMGP）和驅(qū)動 MGP 過表達的重組腺病毒過表達載體（Ad-MGP）, 均購自上海和元生物。其中 Ad-siMGP 的構(gòu)建中，設計針對人 MGP 的 shRNA 干擾雙鏈 DNA 片段，通過分子生物學手段將該干擾片段及綠色熒光蛋白 EGFP 基因重組，并插入到腺病毒穿梭載體（pDKD-CMV-eGFP-U6-shRNA）的 U6 啟動子下游，該載體在干擾 MGP 基因的同時可以表達綠色熒光蛋白 EGFP 基因。對于驅(qū)動 MGP 過表達的 Ad-MGP構(gòu)建，在穿梭載體構(gòu)建的設計時 MGP cDNA 的下游也有 EGFP 融合蛋白序列。重組腺病毒中 EGFP 蛋白的表達便于后續(xù)感染的追蹤和最適感染復數(shù)的確定。
【學位授予單位】：遼寧大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 趙安菊;黃頌敏;歐三桃;王里;陳超;;實時熒光定量PCR法檢測糖尿病腎病大鼠腎臟中BMP-2與MGP[J];貴陽醫(yī)學院學報;2011年05期

相關碩士學位論文 前1條

1 李超文;Fetuin-A和MGP在草酸鈣結(jié)石腎乳頭鈣化斑組織的表達[D];廣西醫(yī)科大學;2015年

本文編號：2625861