【摘要】：研究背景和目的 前列腺癌是發(fā)生在前列腺上皮的惡性腫瘤。其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第二位,在歐美等西方發(fā)達(dá)國(guó)家,前列腺癌在男性腫瘤中發(fā)病率最高。近年來,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率穩(wěn)步升高,發(fā)病年齡日趨年輕化。已躍居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的前三位。但其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍未闡明。 由于前列腺癌起病隱匿,早期無明顯癥狀,往往在例行健康檢查或抽血篩檢時(shí),因前列腺癌特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)值升高后進(jìn)行進(jìn)一步檢查才確診。但目前研究和臨床實(shí)踐觀察到PSA特異性不強(qiáng),多種原因可導(dǎo)致PSA升高。前列腺癌的診斷參考指標(biāo)Gleason評(píng)分,判斷前列腺癌患者預(yù)后及治療方案的重要參考因素,病理評(píng)分偏差會(huì)影響治療方案的選擇,尋找新的診斷指標(biāo)具有緊迫性和重要意義。 大多數(shù)早期前列腺癌是雄激素依賴型的,對(duì)內(nèi)分泌治療敏感,但一般經(jīng)抗雄激素治療12-18個(gè)月后轉(zhuǎn)為雄激素非依賴型前列腺癌(Androgen Independent Prostate Cancer, AIPC),對(duì)內(nèi)分泌治療耐受,患者在雄激素去除后腫瘤仍不斷增殖,病情進(jìn)展惡化,最終導(dǎo)致患者死亡。AIPC患者的生存期一般不超過18個(gè)月.因此前列腺癌的防治仍是一個(gè)難題,闡明前列腺癌發(fā)生的分子機(jī)制,能更好地理解前列腺癌這種復(fù)雜的腫瘤生物學(xué)行為,從而建立有效的檢測(cè)手段,防止和延緩前列腺癌的進(jìn)一步發(fā)展。 近年來研究顯示,PI3/AKt信號(hào)途徑對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌的發(fā)生起重要作用,其信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑可應(yīng)用于前列腺癌的治療。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)是一種廣泛分布在細(xì)胞的磷脂酰肌醇激酶,參與調(diào)解多種細(xì)胞信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能,其活性的增加常與多種癌癥相關(guān)。蛋白激酶B (Protein KinaseB, PKB/Akt)是20多年前發(fā)現(xiàn)的一種v-Akt原癌基因的同源物。生長(zhǎng)因子受體配體相互作用后激活P13K,活化的P13K使PIP2磷酸化為PIP3,然后PIP3協(xié)同PDK1使Akt完全磷酸化而激活。PTEN可使PIP3去磷酸化為PIP2,因而拮抗了PIP3的作用,研究發(fā)現(xiàn),在30%-50%的前列腺癌中常因PTEN的喪失,誘發(fā)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生上調(diào)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白AFAP (actin filament associated protein)是一種小型的接頭蛋白家族,參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn),細(xì)胞骨架的構(gòu)成,可直接激活c-Src,并通過調(diào)節(jié)機(jī)械牽張誘導(dǎo)c-Src的活性。克隆人類AFAP (hAFAP)的過程中,Hann等發(fā)現(xiàn)了一種新型接頭蛋白,命名為AFAP1L-2(actin filament associated protein1-like2),位于染色體10q25.3,編碼一種818個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),因?yàn)榉肿恿看笮∈?30kDa,所以也叫XB130。文獻(xiàn)報(bào)道,XB130作為一種新型接頭蛋白,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控中起重要作用,影響細(xì)胞增殖,存活,運(yùn)動(dòng)和侵襲。 XB130的沉默導(dǎo)致甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力降低,異體移植瘤的生長(zhǎng)速度減慢,提示XB130在甲狀腺癌中為促癌作用。在胃癌發(fā)生發(fā)展中,XB130為促癌作用,但在5-FU治療的胃癌過程中,高表達(dá)XB130患者對(duì)5-FU的敏感性增強(qiáng),從而導(dǎo)致生存率的提高,高表達(dá)XB130可能是是胃癌預(yù)后高生存率和低復(fù)發(fā)率的一個(gè)診斷標(biāo)志物。這樣矛盾的基因差異并不少見,如低表達(dá)的癌基因Bc1-2和Bcl-13為胃癌預(yù)后的不良因素,而抑癌基因p53的過量表達(dá)會(huì)降低整體生存率。最新研究表明,在胰腺導(dǎo)管癌中,XB130高表達(dá)與胰腺導(dǎo)管癌分級(jí)成正相關(guān)。XB130在細(xì)胞質(zhì)彌漫性分布,具有信號(hào)傳導(dǎo)的作用,并且細(xì)胞粘附需要肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白(AFAP)形成肌動(dòng)蛋白纖維,這也是前列腺癌的致瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵。但在前列腺癌中未有任何報(bào)道。 方法 1.組織芯片技術(shù)分析XB130蛋自在人體正常組織和惡性腫瘤組織中的表達(dá) 自行設(shè)計(jì)并制作組織芯片,包括多器官常見癌11種,每種3—5例,癌/正常各1點(diǎn),生殖系統(tǒng)癌4種,每種3—10例,癌/正常各1點(diǎn)。免疫組化方法檢測(cè)XB130蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織及生殖系統(tǒng)癌與正常組織中的的分布和表達(dá)。 2.XB130蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義應(yīng)用免疫組化 EnVisionTM二步法檢測(cè)XB130蛋白在210例帶隨訪資料的前列腺癌組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用x2檢驗(yàn)分析XB130蛋白表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；采用Kaplan-eier法回顧性分析XB130蛋白表達(dá)與前列腺癌患者生存期的關(guān)系；以COX回歸對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3.XB130基因表達(dá)沉默對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 應(yīng)用熒光定量PCR、Western blot等方法檢測(cè)22RV1、LNCap、DU145、PC3等4株前列腺癌細(xì)胞株中的XB130基因/蛋白的表達(dá)情況。 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件設(shè)計(jì)XB130基因干擾片段,用含有XB130基因干擾片段的慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,收集病毒上清并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。用慢病毒感染前列腺癌細(xì)胞株DU145. LNCap細(xì)胞,含空載體的病毒做對(duì)照。Western blot檢測(cè)細(xì)胞干擾效率。利用CCK8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XB130基因沉默后對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析XB130基因沉默后對(duì)前列腺癌細(xì)胞周期的影響；Transwell對(duì)XB130基因沉默后對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響；裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。 4.XB130對(duì)前列腺癌作用的可能機(jī)制的初步探討 通過Western-blot檢測(cè)AKT通路上的位點(diǎn),觀察XB130是否通過AKT通路影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。通過Western Blot檢測(cè)E-cadherin和Vimentin,觀察其是否產(chǎn)生EMT樣改變,從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲 結(jié)果 1.組織芯片技術(shù)分析XB130蛋白在人體正常組織和惡性腫瘤組織和生殖系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá) 判讀統(tǒng)計(jì)兩張芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,15種正常人組織中在胃粘膜、腎皮質(zhì)組織、甲狀腺組織中高表達(dá),肺泡上皮、子宮內(nèi)膜中未見XB130蛋白陽(yáng)性表達(dá),其余組織均為中～低表達(dá)。常見18種腫瘤組織及生殖系統(tǒng)腫瘤中,除子宮頸鱗狀細(xì)胞癌XB130為陰性,其余腫瘤組織中胰腺導(dǎo)管腺癌、前列腺腺癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、乳腺浸潤(rùn)性小葉癌、乳腺導(dǎo)管原位癌、卵巢間變型無性細(xì)胞瘤等腫瘤存在腫瘤細(xì)胞XB130蛋白高表達(dá)；甲狀腺乳頭狀癌、胃腺癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、肝細(xì)胞性肝癌、腎透明細(xì)胞型腎癌、肺鱗狀上皮癌、肺腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、卵巢漿液性乳頭狀腺癌、卵巢囊腺癌等腫瘤可見腫瘤細(xì)胞XB130蛋白低表達(dá)。 2.XB130蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示XB130蛋白在200例前列腺癌組織中的總陽(yáng)性表達(dá)率為85.6%。前列腺癌組織中各級(jí)表達(dá)所占比例分別為：“-”占14.28%(30/210),“+”占26.19%(55/210),“++”占35.71%(75/210),“+++”占23.81%(50/210)。XB130蛋白表達(dá)水平與前列腺癌患者PSA、f-PSA、腫瘤體積的增加和鄰近組織受累范圍的增加及Gleaseon評(píng)分高低相關(guān)。隨訪發(fā)現(xiàn),XB130蛋白高表達(dá)前列腺癌患者生存時(shí)間低于XB130蛋白低表達(dá)患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0121)。將XB130蛋白表達(dá)和臨床病理參數(shù)綜合與前列腺癌患者的生存時(shí)間Cox風(fēng)險(xiǎn)分析,結(jié)果顯示高表達(dá)XB130為影響前列腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素(P=0.0376)。 3.XB130基因在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及干擾XB130后對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 采用熒光定量PCR法檢測(cè)4種人前列腺癌細(xì)胞株中XB130基因的表達(dá)情況。單因素方差分析的結(jié)果表明：4種細(xì)胞株中XB130基因的表達(dá)差異具有顯著性(F=92.752, P0.01), XB130基因在DU145前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外三種前列腺癌細(xì)胞中,LNCap細(xì)胞中XB130基因表達(dá)較高。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,前列腺癌細(xì)胞株中陽(yáng)性表達(dá)與熒光定量PCR結(jié)果一致。 構(gòu)建了XB130的慢病毒干擾載體,包裝慢病毒后感染DU145和LNCap細(xì)胞,利用Western blot技術(shù)檢測(cè)各干擾片段XB130的表達(dá)情況,篩選干擾效率最高的片段A(90%)為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象(命名為DU145/XB130-、 LNCap/XB130-細(xì)胞)。CCK8法觀察XB130基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的增殖情況,與DU145/mock細(xì)胞相比,DU145/XB130-細(xì)胞的增殖速度明顯減慢(F=43.756, P=0.000), LNCap/XB130-與LNCap/mock相比也顯著減慢(F=32.988,P=0.000)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示DU145/XB130-細(xì)胞的活力顯著下降(F=96.563, P=0.000), LNCap/XB130-細(xì)胞活力也顯著降低(F=91.952,P=0.000)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示DU145/XB130-細(xì)胞和LNCap/XB130-細(xì)胞G1-S期的比例減少(P分別為：0.03,0.02)表明XB130基因表達(dá)沉默后細(xì)胞增殖緩慢。綜合結(jié)果表明XB130基因表達(dá)水平減低后,腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)被顯著抑制。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XB130基因沉默后對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：DU145/XB130-、LNCap/XB130-細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于DU145/mock與LNCap/mock,差異具有顯著性(F=85.678,P=0.000)。表明XB130沉默后細(xì)胞的的運(yùn)動(dòng)遷移能力較弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn),裸鼠皮下成瘤結(jié)果顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相比DU145/XB130-和LNCap/XB130-兩組處理組細(xì)胞的裸鼠成瘤速度顯著減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P值分別為DU145/XB130-(P0.01), LNCap/XB130-(P0.001),提示干擾XB130基因后,DU145和LNCap細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度顯著降低。 4.XB130促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲機(jī)制的初步探討 通過Western Blot對(duì)沉默掉XB130的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,AKT通路相關(guān)磷酸化指標(biāo)p-PDK1、p-c-Raf, Thr308降低,p-PTEN升高而總AKT不變。結(jié)果表明XB130是通過AKT信號(hào)通路調(diào)控前列腺癌。之后通過Western Blot檢測(cè)E-cadherin和Vimentin,我們發(fā)現(xiàn)沉默掉XB130后E-cadherin增高, Vimentin降低。表明XB130參與Akt磷酸化和EMT樣改變,從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。 結(jié)論 1.XB130蛋白在多種腫瘤組織中高表達(dá),表明XB130可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子； 2.XB130蛋白高表達(dá)結(jié)合臨床隨訪資料分析,表明高XB130與患者生存時(shí)間密切相關(guān),提示XB130可作為前列腺癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo),對(duì)判斷前列腺癌預(yù)后有重要意義； 3.檢測(cè)XB130蛋白在前列腺癌細(xì)胞株DU145和LNCap中高表達(dá),22RV1和PC3中低表達(dá),考慮與細(xì)胞來源不同相關(guān)。XB130基因沉默,抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。 4.XB130參與Akt磷酸化和EMT樣改變。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2521997