【摘要】：研究目的檢測(cè)軟脂酸（PA）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）及其下游炎癥因子IL-6和TNF-ɑ表達(dá)的影響，探討游離脂肪酸（FFAs）在引發(fā)腎臟微炎癥反應(yīng)的相關(guān)作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法用含有軟脂酸濃度為（0μ mol/L、125μ mol/L、250μ mol/L、500μ mol/L）的DMEM培養(yǎng)液對(duì)正常的大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）進(jìn)行干預(yù)。①于干預(yù)24小時(shí)后觀察NRK-52E的形態(tài)學(xué)的變化；②采用MTT法檢測(cè)不同濃度的軟脂酸干預(yù)12h,24h后NRK-52E的增殖情況；③相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞12h，，24h，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞TLR4mRNA水平；④用流式細(xì)胞術(shù)儀(flow cytometry，F(xiàn)C)檢測(cè)軟脂酸干預(yù)24小時(shí)后NRK-52E表面TLR4的蛋白水平；⑤采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)軟脂酸作用12h，24h后不同濃度組上清液中白介素-6（IL-6）與腫瘤壞死因子-α （TNF-ɑ）的表達(dá)情況。 主要結(jié)果 1.NRK-52E細(xì)胞形態(tài)正常NRK-52E細(xì)胞為類圓形的貼壁細(xì)胞,鋪滿、融合后細(xì)胞呈鋪路石狀貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)24小時(shí)不同濃度軟脂酸干預(yù)后,由緊密連接的類圓形細(xì)胞拉長(zhǎng)為連接松散的梭形細(xì)胞,其中500μ mol/L濃度的軟脂酸干預(yù)后細(xì)胞變化尤為明顯。 2.MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞處理12h，24h終點(diǎn)時(shí)：d-BSA組與空白對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05），說明d-BSA作為軟脂酸與NRK-52E細(xì)胞結(jié)合的載體，對(duì)NRK-52E細(xì)胞的增值不產(chǎn)生有意義的影響；各軟脂酸組與空白對(duì)照組比較，OD值明顯減小，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)；三組不同濃度軟脂酸組之間兩兩比較，OD值隨著軟脂酸濃度的增加逐漸減小，且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。相同濃度組不同時(shí)間段比較：24小時(shí)較12小時(shí)OD值有所降低，且各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 3.PCR檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞處理12小時(shí)結(jié)果：不同組之間細(xì)胞內(nèi)TLR4的mRNA表達(dá)量總體有差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PA125μ mol/L組與d-BSA對(duì)照組相比TLR4的mRNA表達(dá)上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PA250μ mol/L組與d-BSA對(duì)照組及PA125μ mol/L組相比TLR4的mRNA表達(dá)上調(diào)，但與PA125μmol/L組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能在軟脂酸干預(yù)的早期，這兩組濃度軟脂酸不足以引起TLR4的mRNA的差異性表達(dá)；PA500μ mol/L組與其它任意組比較，TLR4的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；綜上說明在干預(yù)12小時(shí)終點(diǎn)時(shí)，TLR4的mRNA表達(dá)隨著軟脂酸濃度增高而增加，且在500μ mol/L濃度時(shí)其表達(dá)更是明顯增加。細(xì)胞處理24小時(shí)結(jié)果：不同組之間細(xì)胞內(nèi)TLR4的mRNA表達(dá)量總體有差別，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PA125μ mol/L組與d-BSA對(duì)照組相比、PA250μ mol/L組與PA125μ mol/L組相比、PA500μ mol/L組與PA250μ mol/L組相比表達(dá)均上調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明在干預(yù)24小時(shí)終點(diǎn)時(shí)，TLR4的mRNA表達(dá)與軟脂酸的濃度之間呈一定的濃度依賴關(guān)系。相同濃度組不同時(shí)間段比較：24小時(shí)較12小時(shí)表達(dá)有所增高，其中PA250μ mol/L組與PA500μ mol/L組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果不同濃度的軟脂酸處理腎小管上皮細(xì)胞24h后，與對(duì)照組相比細(xì)胞膜TLR4蛋白水平明顯增高，并隨濃度增高而增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），三組不同濃度軟脂酸組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.ELISA方法檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞處理12h，24h終點(diǎn)時(shí)：d-BSA組與空白對(duì)照組上清液中可檢測(cè)到微量IL-6、TNF-ɑ，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；12小時(shí)低濃度IL-6組與空白對(duì)照組比較，分泌有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；其余各軟脂酸組干預(yù)組與空白對(duì)照組比較且各組兩兩比較，有的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，且IL-6、TNF-ɑ的分泌隨PA濃度的增加明顯增多；相同的處理濃度，干預(yù)24小時(shí)組較干預(yù)12小時(shí)組IL-6、TNF-ɑ的分泌明顯增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 主要結(jié)論 1.腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖受到軟脂酸作用的影響。并且在12h及24h，0μ mol/L-500μ mol/L濃度范圍內(nèi)軟脂酸的濃度與細(xì)胞的增殖呈負(fù)相關(guān)。 2.軟脂酸可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)增高。 3.軟脂酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞膜上TLR4蛋白的表達(dá)增高。 4.軟脂酸可以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞IL-6及TNF-α的分泌，且IL-6、TNF-α分泌的高峰與TLR4mRNA及在細(xì)胞膜上蛋白表達(dá)的高峰基本接近，提示IL-6、TNF-α的增高可能與細(xì)胞膜上TLR4蛋白的表達(dá)有關(guān)，進(jìn)一步推論，可能是軟脂酸通過作用TLR4而間接促發(fā)炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R587.2;R692

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本文編號(hào)：2417955