【摘要】：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤。全球,男性膀胱癌的發(fā)病率位于第七位,女性膀胱癌的發(fā)病率位列第十七。在中國(guó),膀胱癌發(fā)病率與死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤首位,男女發(fā)病比例約為4：1。膀胱癌的病理類(lèi)型一般為移行上皮細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌及腺癌,其中超過(guò)90%為移行細(xì)胞癌。膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的最主要方法。膀胱癌與其他腫瘤顯著的不同點(diǎn)在于易復(fù)發(fā)性,復(fù)發(fā)的次數(shù)與膀胱癌惡性程度及進(jìn)展息息相關(guān)。膀胱癌發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段的過(guò)程,由于其發(fā)病機(jī)制尚不甚清楚,且復(fù)發(fā)率很高,無(wú)有效的治療方法,因而難以對(duì)膀胱癌實(shí)施有效的預(yù)防與干預(yù)。目前認(rèn)為吸煙與職業(yè)暴露是膀胱癌發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素。另有研究表明,若父母患膀胱癌,其子女罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)將大大增高,提示遺傳因素在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),個(gè)體遺傳因素在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。如,群體中的大多數(shù)人都接觸相同的環(huán)境危險(xiǎn)因素,但是只有少部分人最終發(fā)生膀胱癌,提示個(gè)體遺傳易感性存在差異。 人類(lèi)基因組計(jì)劃也已確認(rèn),基因遺傳變異將會(huì)對(duì)基因的表達(dá)、結(jié)構(gòu)以及功能產(chǎn)生影響,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體部分生物學(xué)功能的改變。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是最常見(jiàn)的基因遺傳變異。SNPs能夠通過(guò)改變基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)量,從而影響基因?qū)C(jī)體的調(diào)控作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),p53介導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)(MDM2、p53).DNA修復(fù)(XRCC1、 APE1、ADPRT)、細(xì)胞凋亡(CASP8、FAS、FASL)、免疫炎癥(IL4、IL4R,IL13)和葉酸代謝(MTHFR、MTR、MTRR)等多個(gè)生物學(xué)通路中基因SNPs與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái),全基因組關(guān)聯(lián)研究的出現(xiàn)為膀胱癌遺傳易感性的研究提供了強(qiáng)有力的工具。Kiemeney和Wu等人在歐美人群中采用全基因組關(guān)聯(lián)研究方法,發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與膀胱癌遺傳易感相關(guān)的區(qū)域或基因,如染色體8q24區(qū)域的rs9642880、3q28區(qū)域的rs710521和PSCA基因rs2294008等。截至目前,共確認(rèn)13個(gè)與歐美人群膀胱癌易感性相關(guān)的SNPs。由此表明,個(gè)體遺傳易感性在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中的確起著重要作用。 miRNAs (microRNAs,微小RNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～23個(gè)核苷酸的進(jìn)化上保守的非編碼小RNA分子,可參與包括細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),單個(gè)SNP作用或多個(gè)SNPs間的聯(lián)合作用與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后顯著相關(guān),且可存在明顯的環(huán)境-基因、基因-基因交互作用。但其確切的機(jī)制尚不很清楚。早在2008年,Hu等人就發(fā)現(xiàn)miR-196a2上的rs11614913位點(diǎn)可以影響miRNA從pre-miRNA到成熟miRNA的過(guò)程,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是miRNA基因遺傳變異在膀胱癌中的研究甚少。近來(lái)的研究表明,miRNAs異常表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：當(dāng)pri-miRNAs (primary miRNAs,初級(jí)miRNAs)存在SNPs,可能會(huì)影響pre-miRNAs (precursor miRNAs,前體miRNAs)的生成進(jìn)而導(dǎo)致成熟miRNAs的表達(dá)水平異常；miRNAs生成過(guò)程中需要多個(gè)關(guān)鍵基因的參與(如DICER、 DROSHA等基因),因此miRNAs生成通路關(guān)鍵基因發(fā)生遺傳變異時(shí),可能會(huì)影響關(guān)鍵基因的表達(dá)量或結(jié)構(gòu)功能,最終可致miRNA表達(dá)水平的異常。眾所周知,miRNAs發(fā)揮調(diào)控作用是通過(guò)與靶基因3'UTR(3'untranslate region,非翻譯區(qū))結(jié)合引起靶基因mRNA降解或翻譯抑制的,從而參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。因此,當(dāng)SNPs位于成熟miRNAs上,可直接影響miRNAs對(duì)靶基因的調(diào)控作用；類(lèi)似地,當(dāng)SNPs位于其靶基因3'UTR與miRNA結(jié)合的部位或鄰近部位,將影響miRNAs與靶基因3'UTR的結(jié)合能力。綜上可見(jiàn),miRNAs相關(guān)基因遺傳變異與腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用,但是關(guān)于膀胱癌的研究報(bào)道甚少。 本研究擬進(jìn)一步通過(guò)系統(tǒng)探討miRNAs遺傳變異、miRNAs靶基因遺傳變異及miRNAs生成通路關(guān)鍵基因遺傳變異在膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中的作用及其可能生物學(xué)機(jī)制,為今后膀胱癌的個(gè)體化預(yù)防、干預(yù)與治療提供理論依據(jù)。 第一部分miRNAs基因遺傳變異與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性及機(jī)制研究 近年來(lái),miRNAs逐漸為人們所熟悉,被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在通過(guò)分子流行病學(xué)病例-對(duì)照研究探討miRNAs基因遺傳變異與膀胱癌發(fā)病及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性,并探討其可能的生物學(xué)機(jī)制。首先我們基于miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到564個(gè)miRNAs,隨后結(jié)合HapMap、dbSNP及Patrocles數(shù)據(jù)庫(kù)篩選符合要求的miRNAs基因SNPs;另外還聯(lián)合使用Gibbs結(jié)合能計(jì)算,最終納入5個(gè)位于miRNAs基因上的候選SNPs(miR-146a rs2910164miR-196a2rs11614913、miR-605rs2043556、miR-618rs2682818和miR-923rs47960429)。 本研究采用包括1,019例膀胱癌病例與1,182例健康對(duì)照的兩階段分子流行病學(xué)病例-對(duì)照研究方法分析候選SNPs與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)性,其中一階段研究包括683例病例和728例對(duì)照,二階段研究中包括336例病例和454例對(duì)照)。第一階段結(jié)果顯示：在五個(gè)候選SNPs中僅發(fā)現(xiàn)miR-146a基因rs2910164C和miR-618基因rs2682818A等位基因與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低呈顯著關(guān)聯(lián)(miR-146a基因rs2910164C：調(diào)整OR=0.80,95%CI=0.69-0.93,P=0.004；miR-618基因rs2682818A：調(diào)整OR=0.81,95%CI=0.69-0.96,P=0.013)。但經(jīng)Bonferroni校正后,發(fā)現(xiàn)miR-618基因rs2682818與膀胱癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的意義消失(P=0.064)。進(jìn)一步對(duì)上述兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行二階段驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-146a基因rs2910164C等位基因仍能降低個(gè)體罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整OR=0.80,95%CI=0.66-0.98,P=0.030),但未觀察到miR-618基因rs2682818A等位基因與膀胱癌發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)性(調(diào)整OR=0.84,95%CI=0.67-1.05,P=0.126)。在此基礎(chǔ)上,將兩階段樣本進(jìn)行合并再行分析后發(fā)現(xiàn),僅miR-146a基因rs2910164C等位基因可顯著降低個(gè)體罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整OR=0.80,95%CI=0.71.0.90,P=2.92×104)。進(jìn)一步分層分析顯示,男性攜帶rs2910164C等位基因較攜帶G等位基因罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)降低(調(diào)整OR=0.76,95%CI=0.66-0.87)；另外,與攜帶G等位基因者相比,攜帶C等位基因者無(wú)論年齡大小(≤65歲：調(diào)整OR=0.82,95%CI=0.69-0.97；65歲：調(diào)整OR=0.78,95%CI=0.66-0.92)、是否吸煙(不吸煙：調(diào)整OR=0.80,95%CI=0.69-0.93；吸煙：調(diào)整OR=0.80,95%CI=0.67-0.96)、腫瘤分級(jí)(低級(jí)：調(diào)整OR=0.83,95%CI=0.73-0.94:高級(jí)：調(diào)整OR=0.66,95%CI=0.52-0.85)及腫瘤分期(淺表性：調(diào)整OR=0.78,95%CI=0.68-0.89；浸潤(rùn)性：調(diào)整OR=0.83,95%CI=0.70-0.99),均可降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。我們還針對(duì)199例具備完整隨訪資料的膀胱癌患者分析了miR-146a基因rs2910164與膀胱癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,攜帶rs2910164C等位基因(GC和CC基因型)者較不攜帶C等位基因(GG基因型)者可顯著降低膀胱癌的復(fù)發(fā)(HR=0.58,95%CI=0.36-0.94,P=0.016)�；谏鲜鲫P(guān)聯(lián)性研究結(jié)果,我們還探討了miR-146a基因rs2910164的功能學(xué)意義。結(jié)果表明,miR-146a基因rs2910164可通過(guò)調(diào)控IRAK1和TRAF6靶基因影響膀胱癌細(xì)胞增殖。另外,采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)64例膀胱癌組織中miR-146a的表達(dá)水平,結(jié)果顯示攜帶rs2910164CC基因型者的miR-146a表達(dá)水平顯著高于攜帶GG與GC基因型的膀胱癌患者約2倍(P=0.010)。以上研究結(jié)果提示,miR-146a基因rs2910164遺傳變異與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在明顯關(guān)聯(lián),其機(jī)制可能與rs2910164變異影響了miR-146a對(duì)靶基因IRAK1和TRAF6的增殖調(diào)控有關(guān)。 第二部分miRNAs靶基因EGFR3’UTR遺傳變異與膀胱癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性及機(jī)制研究 已知miRNAs靶基因遺傳變異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明,表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種酪氨酸激酶跨膜受體,廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上,過(guò)表達(dá)后將啟動(dòng)下游信號(hào)通路而參與對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)重要生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控,與腫瘤(包括膀胱癌)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。EGFR基因終止密碼子下游3'UTR的第774-bp處TC多態(tài)變異(774TC,rs884225)處在miR-214的結(jié)合區(qū)域,我們推測(cè)該變異可干擾miR-214與EGFR基因mRNA的結(jié)合,進(jìn)而影響EGFR基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究擬運(yùn)用病例-對(duì)照研究方法,其中包括908例膀胱癌病例和1,239例健康對(duì)照,采用TaqMan基因分型方法探討EGFR基因3'UTR774TC位點(diǎn)與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與攜帶774TT/TC基因型者相比,攜帶774CC基因型者罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(調(diào)整OR=1.29,95%CI=1.05-1.58)。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn),攜帶774CC基因型者較攜帶TT和TC基因型者罹患膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)在高齡(65歲)(調(diào)整OR=1.87,95%CI=1.39-2.53)、不吸煙人中更顯著(調(diào)整OR=1.46,95%CI=1.11-1.92)；在腫瘤分級(jí)為中級(jí)、腫瘤分期為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中,攜帶CC基因型者較TT和TC基因型者膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(中級(jí)：調(diào)整OR=1.34,95%CI=1.01-1.80；浸潤(rùn)性：調(diào)整OR=1.40,95%CI=1.05.1.89)。另外,采用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探討miR-214與EGFR基因3'UTR774TC位點(diǎn)之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示：將包含774T、774C、774D(D:刪除包含該變異位點(diǎn)的18-bp序列)的三種質(zhì)粒和內(nèi)參瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到T24細(xì)胞中同時(shí)共轉(zhuǎn)染NC(negative control,陰性對(duì)照)miRNA或者miR-214。對(duì)于轉(zhuǎn)染NC組：C vs.T,P0.05；Dvs.T,P0.05。對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-214的組：Cvs.T,P0.05；D vs.T,P0.05。但是,與NC組相比,并未觀察到miR-214對(duì)靶基因存在特異性的調(diào)節(jié)作用(P值均0.05)。該雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果提示,EGFR基因3'UTR774TC位點(diǎn)的變化可影響EGFR的表達(dá)水平,推測(cè)可能是存在其他miRNAs參與調(diào)節(jié)EGFR的表達(dá)而非miR-214或miR-214所起的作用較微弱。以上結(jié)果表明,miRNA靶基因EGFR3'UTR774TC位點(diǎn)可增加膀胱癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),且該作用在高齡(65歲)、不吸煙、腫瘤分級(jí)為中級(jí)、腫瘤分期為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中更顯著。 第三部分miRNAs生成通路中關(guān)鍵基因遺傳變異與膀胱癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性及機(jī)制研究 DICER和1ROSHA基因是miRNAs生成通路中的兩個(gè)關(guān)鍵基因。DICER和DROSHA蛋白是miRNA生成通路上至關(guān)重要的兩種RNA酶。本研究旨在探討miRNA生成通路中關(guān)鍵基因DICER和DROSHA遺傳變異與膀胱癌易感性之間的關(guān)系及其可能的生物學(xué)機(jī)制。運(yùn)用分子流行病學(xué)病例-對(duì)照研究方法(685例膀胱癌病例和730例健康對(duì)照),探討DICER和DROSHA基因7個(gè)功能性的SNPs(即DICER rs12323635CT、rs13078TA. rs1057035TC、rs3742330AG和DROSHArs2291109AT、rs10719TC、s642321CT)與膀胱癌發(fā)病危險(xiǎn)性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：ICER rs12323635CT、 rs13078TA、rs1057035TC及rs3742330AG和DROSHA rs2291109AT、rs642321CT與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間均無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P值均0.05),但發(fā)現(xiàn)位于DROSHA基因3'UTR的rs10719TC位點(diǎn)可明顯增加膀胱癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),其中,與攜帶rs10719TT基因型者相比,攜帶rs10719TC和CC基因型者罹患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了0.25倍(調(diào)整OR=1.25,95%CI=1.01-1.55,P=0.041)。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn),DROSHA基因3'UTRrs10719TC位點(diǎn)可增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),特別是在男性(調(diào)整OR=1.34,95%CI=1.05-1.90,P=0.018)和吸煙人群(調(diào)整OR=1.56,95%CI=1.14-2.14,P=0.006)中更為顯著。隨后,采用TargetScan、miRanda、Microcosm PITA四個(gè)miRNA預(yù)測(cè)網(wǎng)站同時(shí)預(yù)測(cè)到miR-27a/b與DROSHA基因3'UTR存在不完全互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域,提示1DROSHA為miR-27a/b的靶基因。miR-27a/b與DROSHA的3'UTR的靶向結(jié)合位點(diǎn)位于rs10719TC位點(diǎn)上游約46-bp處�；谏鲜錾镄畔W(xué)分析,本課題運(yùn)用雙熒光報(bào)告基因方法探討rs10719TC位點(diǎn)是否會(huì)影響miR-27a/b與DROSHA3'UTR的結(jié)合能力進(jìn)而影響DROSHA基因轉(zhuǎn)錄后翻譯。結(jié)果顯示,T24細(xì)胞株中：與轉(zhuǎn)染NC組相比,共轉(zhuǎn)染miR-27a/b mimics與rs10719T質(zhì)粒會(huì)抑制熒光素酶的表達(dá)水平(P值分別為0.004和0.001),但是共轉(zhuǎn)染miR-27a/b與rs10719C質(zhì)粒并未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；對(duì)應(yīng)的在J82細(xì)胞中：共轉(zhuǎn)染miR-27a/b inhibitor與rs10719T質(zhì)粒后較NC組,其熒光素酶的表達(dá)水平上升了(P值分別為0.012和0.002),但是還發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-27a/b inhibitor與rs10719C質(zhì)粒后,干擾掉miR-27a表達(dá)組其熒光素酶表達(dá)水平竟下降,另外共轉(zhuǎn)染miR-27b與rsl0719C質(zhì)粒并未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)果提示,DROSHA基因3'UTR rs10719TC位點(diǎn)變化可能會(huì)影響miR-27b與該基因3'UTR的結(jié)合能力。綜上可見(jiàn),DROSHA基因3'UTR rs107f9TC多態(tài)位點(diǎn)可增加膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),而rs10719TC位點(diǎn)變異可能會(huì)影響miR-27b與DROSHA基因3'UTR的結(jié)合能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2267707