【摘要】：研究背景及目的前列腺癌作為威脅男性健康最常見腫瘤之一,其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家高居男性腫瘤首位,占全部惡性腫瘤的28%,死亡率僅次于肺癌。2008年全世界范圍內(nèi)前列腺癌新發(fā)病例約899000例,死亡病例約258000例,其中72%的新發(fā)病例和53%的死亡病例均發(fā)生于歐洲、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家。在世界范圍內(nèi)亞洲地區(qū)的前列腺癌發(fā)病率是最低的,但是近年來也有明顯上升趨勢(shì)。中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率與死亡率雖遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家,但近年來隨著人口老齡化、環(huán)境污染和生活條件的改善,發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì),早已成為影響男性健康的主要因素。不斷上升的發(fā)病率使前列腺癌的研究越來越受到關(guān)注重視。1941年,Huggins等首次闡述了通過切除睪丸去除雄激素能夠抑制前列腺的生長(zhǎng),并且能夠在轉(zhuǎn)移前列腺癌患者身上產(chǎn)生戲劇化的主觀和客觀的效果。這一發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的治療揭開了新篇章,也是對(duì)激素依賴性癌癥治療的重大突破。從此內(nèi)分泌治療在前列腺癌治療中占據(jù)經(jīng)久不衰的重要地位。隨著去雄激素治療這一概念的提出,在20世紀(jì)50年代有許多雌激素治療前列腺癌的報(bào)道。然而,內(nèi)分泌治療平均1.5年-2年的時(shí)間,幾乎所有的患者的病變都會(huì)逐漸進(jìn)展為激素非依賴性前列腺癌或者激素難治性前列腺癌,將不能再憑借激素來治療。而對(duì)于激素非依賴性前列腺癌,當(dāng)前還沒有標(biāo)準(zhǔn)且有效的治療方案,最后導(dǎo)致病情惡化,治療失敗。到現(xiàn)在為止,前列腺癌發(fā)生雄激素非依賴性改變的機(jī)制還沒有完全清楚。近些年來,不論在基礎(chǔ)還是在臨床研究中,對(duì)于前列腺癌的治療方法的研究成為一個(gè)活躍的領(lǐng)域。腫瘤是一類多基因疾病,細(xì)胞基因組完整性的改變是腫瘤發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制是細(xì)胞基因組完整性的重要保證,如果監(jiān)控機(jī)制發(fā)生破壞,則導(dǎo)致細(xì)胞遺傳的不穩(wěn)定性,染色體發(fā)生重排,如基因缺失、擴(kuò)增和及移位等,當(dāng)突變基因的累積破壞了細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)機(jī)制,將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生失控性生長(zhǎng),最后導(dǎo)致癌變。細(xì)胞分裂周期的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程,這一過程涉及到幾乎全部的癌基因、抑癌基因的生物學(xué)效應(yīng)。許多癌基因、抑癌基因直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控,或者本身就是細(xì)胞周期調(diào)控復(fù)合體的主要成分。這些基因變異的結(jié)果,造成了細(xì)胞周期的失控,失去控制的細(xì)胞將無限制增殖,形成的克隆群體便是腫瘤。因此,有學(xué)者指出腫瘤是一類細(xì)胞周期疾病。慢病毒載體(lentiviral vector,LV)作為一類來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體,以其轉(zhuǎn)染效率高,可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞,可容納較大的基因片段等優(yōu)點(diǎn),在科研領(lǐng)域有著良好的發(fā)展前景。RNA干擾(RNA interference,RNAi)其機(jī)制是通過抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來抑制基因表達(dá)。將與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA導(dǎo)人細(xì)胞中,雙鏈RNA先降解為小干擾RNA(Small interfering RNA,即siRNA),隨后siRNA與一些蛋白合成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA—inducedsilencing complex,RISC),引發(fā)靶mRNA降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。將慢病毒載體作為RNAi技術(shù)的載體,可以結(jié)合兩者優(yōu)勢(shì)特異性抑制哺乳動(dòng)物的各類細(xì)胞中基因的表達(dá),成為基因功能研究和基因治療的有力手段。因此近年來RNAi技術(shù)和慢病毒載體技術(shù)的發(fā)展已為前列腺癌治療的研究提供了一種新思路。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程,在多因素(包括環(huán)境因素和遺傳因素)作用下,導(dǎo)致原癌基因的激活和抑癌基因功能的喪失.在腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展過程中,隨著基因突變的積累,導(dǎo)致其逃避正常的細(xì)胞分裂調(diào)控機(jī)制、細(xì)胞凋亡能力下降、向周圍組織入侵和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力增加。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)行、凋亡及轉(zhuǎn)移的機(jī)制非常復(fù)雜,已知有大量蛋白質(zhì)分子參與了這些過程。最近,韓趙東等應(yīng)用雙向電泳及質(zhì)譜分析的方法鑒定出2566種腫瘤蛋白,并通過生物信息學(xué)分析出有60個(gè)差異性蛋白在前列腺癌中,其中表達(dá)為上調(diào)的有37個(gè),而表達(dá)為下調(diào)的則有23個(gè)。而其中有14種基因及其蛋白產(chǎn)物(ACLY,CAPG,GSTM3,GSTP1,HNRNPL,IMPDH2,KRT15,MCCC2,MSN,MYL9,PYGB,SERPINB5,TRAP1 and VCL)在前列腺癌中表達(dá)具有明顯的差異。在真核生物細(xì)胞中,由基因組DNA通過轉(zhuǎn)錄直接生成的RNA由于其隨機(jī)分布在核內(nèi),且長(zhǎng)短不一,故被稱作核內(nèi)不均一性RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。在hnRNA經(jīng)加工成為成熟mRNA的過程中,需要很多蛋白質(zhì)的參與。根據(jù)結(jié)合的RNA種類的不同,這些蛋白可以分作3類:核小核糖核蛋白(snRNP),mRNA蛋白(mRNP)和核內(nèi)不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein,hnRNP)。研究發(fā)現(xiàn),hnRNP家族中的各成員在DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、hnRNA剪接mRNA輸送、降解等生物過程中發(fā)揮著重要作用。核不均一蛋白L(HnRNPL)是由Pinol-Roma S等在早期轉(zhuǎn)錄片段中意外發(fā)現(xiàn)的核糖核蛋白,這種蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,是核不均一核糖核蛋白(核蛋白)復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分。已知在肺癌中存在,并與肺癌的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)系,同時(shí)我們前期的研究已經(jīng)證實(shí)了HnRNP L與生精細(xì)胞的增值和凋亡關(guān)系密切。hnRNPs家族中的HnRNPK已被報(bào)道和前列腺癌有著緊密的關(guān)系,并參與前列腺癌的增值、分化以及凋亡過程。我們前期用組織芯片(81點(diǎn)前列腺增生組織及99點(diǎn)前列腺癌組織)進(jìn)行免疫組化,結(jié)果顯示,HnRNP L蛋白在前列腺癌中高表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致。因此,本課題的設(shè)計(jì)思路:用HnRNP L慢病毒感染前列腺癌細(xì)胞,建立穩(wěn)定低表達(dá)HnRNP L蛋白的前列腺癌細(xì)胞株;在此基礎(chǔ)上,探導(dǎo)HnRNP L蛋白可能參與的前列腺癌細(xì)胞信號(hào)通路;并且進(jìn)行HnRNPL對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的在體研究,揭示HnRNP L參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,同時(shí)為前列腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。方法:1、慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞并且用Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果實(shí)驗(yàn)分為第一組(陰性對(duì)照組:PC3細(xì)胞+慢病毒陰性對(duì)照),第二組(干擾組:PC3細(xì)胞+HnRNP L慢病毒),慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞72小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率;并且用Western Blot檢測(cè)HnRNP L蛋白在兩組中的表達(dá),檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。2、慢病毒沉默 HnRNPL 基因?qū)?PC3 細(xì)胞 Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1基因表達(dá)的影響用Western Blot和RT-PCR檢測(cè)陰性對(duì)照組和干擾組中Bcl-2、caspase-3、caspase-9、iNOS、CEACAM1 表達(dá)的變化。3、HnRNPL對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的在體研究用陰性對(duì)照組和干擾組細(xì)胞分別注射到5只裸鼠皮下,構(gòu)建前列腺癌裸鼠移植瘤,定期觀察裸鼠生長(zhǎng)情況及裸鼠皮下腫瘤形成情況,裸鼠飼養(yǎng)至4周時(shí)處死,取下腫瘤,制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察腫瘤的病理結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1、慢病毒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞72小時(shí)后熒光顯微鏡白光下觀察成上皮細(xì)胞形態(tài),生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在激發(fā)光下,部分PC3細(xì)胞能發(fā)出綠色熒光,熒光較均勻的分布于整個(gè)細(xì)胞,慢病毒的轉(zhuǎn)染效率較高。Western blot結(jié)果顯示,干擾組PC3細(xì)胞的HnRNP L蛋白被成功下調(diào),我們成功建立了穩(wěn)定低表達(dá)HnRNPL蛋白的前列腺癌細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞基礎(chǔ)。2、Western blot結(jié)果顯示,PC3細(xì)胞中下調(diào)HnRNPL后,Bcl-2表達(dá)量沒有明顯的差異,而激活型caspase-3和激活型caspase-9的表達(dá)量升高;RT-PCR結(jié)果顯示,在下調(diào)HnRNP L后,PC3細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)量無明顯變化(t=0.063,P=0.956),但是 iNOSmRNA 的表達(dá)量顯著下調(diào)(t=27.152,P=0.001),CEACAM1mRNA 的表達(dá)量也顯著下降(t=127.891,P=0.000)。3、干擾組和陰性對(duì)照組裸鼠分別皮下注射干擾組和陰性對(duì)照組PC3細(xì)胞,4周后,陰性對(duì)照組裸鼠均長(zhǎng)出腫瘤,將陰性對(duì)照組裸鼠處死,取出移植瘤,而干擾組裸鼠4周內(nèi)均未長(zhǎng)出腫瘤。陰性對(duì)照組腫瘤HE染色顯示:腫瘤細(xì)胞呈無規(guī)則分布,細(xì)胞體積明顯增大,典型的核大漿少且核大小不一,較多病理性核分裂現(xiàn)象,無明顯腺體結(jié)構(gòu)存在。結(jié)論:1、我們用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法成功建立了穩(wěn)定、高效、均一的低表達(dá)HnRNP L蛋白的前列腺癌細(xì)胞,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。2、在PC3細(xì)胞中下調(diào)HnRNP L的表達(dá)后,可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,其凋亡增加可能是與 caspase-3、caspase-9、iNOS 及 CEACAM1 通路有關(guān)3、下調(diào)HnRNPL蛋白的表達(dá)可能會(huì)有抑制前列腺癌腫瘤形成的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25
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本文編號(hào)：
2261755
