本文選題：補(bǔ)體應(yīng)答基因 + 髓鋅指基因��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》2015年02期

【摘要】：目的 :構(gòu)建大鼠補(bǔ)體應(yīng)答基因32(response gene to complement,RGC32)啟動子(全長和截短)熒光素酶報告質(zhì)粒,并觀察人胚腎細(xì)胞(HEK293)過表達(dá)髓鋅指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)對大鼠RGC32基因啟動活性的影響。同時,篩選其可能的MZF1結(jié)合位點。方法:將RGC32基因啟動子全長(-686~-1 nt)插入到熒光素酶報告基因載體p GL3-basic中,獲得RGC32基因啟動子全長熒光素酶報告質(zhì)粒(p GL3-RGC32-FL)后,再將p GL3-RGC32-FL與本課題組前期構(gòu)建的大鼠野生型MZF1表達(dá)質(zhì)粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,檢測其熒光素酶活性,以確定MZF1對RGC32基因的啟動作用。另用生物信息學(xué)軟件預(yù)測RGC32基因啟動子上轉(zhuǎn)錄因子MZF1潛在的結(jié)合位點,并據(jù)此構(gòu)建3個RGC32基因啟動子截短的熒光素酶報告質(zhì)粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。將上述RGC32基因啟動子全長和各截短的熒光素酶報告質(zhì)粒與MZF1過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,再行熒光素酶活性測定,以篩選MZF1的結(jié)合位點。結(jié)果:菌液PCR及核酸測序證實,大鼠RGC32基因啟動子(全長和各截短)的熒光素酶報告質(zhì)粒均構(gòu)建成功。將p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞發(fā)現(xiàn),RGC32基因啟動子活性顯著增加。而將p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分別與p IRES2-EGFP-MZF1共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后顯示,p GL3-RGC32-3的啟動活性顯著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能結(jié)合在RGC32基因啟動子的-286~-86 nt區(qū)域。結(jié)論 :成功構(gòu)建了大鼠RGC32基因啟動子全長及截短熒光素酶報告質(zhì)粒,證實過表達(dá)MZF1可促進(jìn)RGC32基因的啟動,并初步篩查出轉(zhuǎn)錄因子MZF1在RGC32基因啟動子上可能的結(jié)合區(qū)域。
[Abstract]:Aim: to construct the luciferase reporter plasmid (full-length and truncated) of the rat complement response gene (32(response gene to complementation rGC32), and to observe the effect of overexpression of medullary zinc finger gene (1(myeloid zinc finger gene1mZF1) on the activity of rat RGC32 gene. At the same time, the possible MZF1 binding sites were screened. Methods: the full-length RGC32 promoter was inserted into the luciferase reporter gene vector pGL3-basic, and the full-length luciferase reporter plasmid pGL3-RGC32-FLR of RGC32 gene promoter was obtained. Then pGL3-RGC32-FL was co-transfected into HEK293 cells by pIRES2-EGFP-MZF1, which was constructed by our team. The luciferase activity was detected to determine the priming effect of MZF1 on RGC32 gene. In addition, bioinformatics software was used to predict the potential binding sites of transcription factor MZF1 on the promoter of RGC32 gene, and three luciferase reporter plasmids (pGL3-RGC32-1, pGL3-RGC32-2 and pGL3-RGC32-3pGL3-RGC32-3) were constructed. The full-length and truncated luciferase reporter plasmids of RGC32 gene were co-transfected into HEK293 cells with MZF1 overexpression plasmids. The luciferase activity was determined to screen the binding sites of MZF1. Results: PCR and nucleic acid sequencing confirmed that the luciferase reporter plasmids of rat RGC32 gene promoter (full length and each truncation) were successfully constructed. Co-transfection of pGL3-RGC32-FL and pIRES2-EGFPMZF1 into HEK293 cells revealed a significant increase in the promoter activity of RGC32 gene. However, the priming activity of pGL3-RGC32-FL32 / pGL3-RGC32-1 / pGL3-RGC32-2 and pGL3-RGC32-3 / pGL3-RGC3F1 / pIRES2-EGFP-MZF1 was significantly lower than that of pGL3-RGC32-FLPGL3-RGC32-1 and pGL3-RGC32-1, respectively, and the priming activity of pGL3-RGC32-FLP GL3-RGC32-1 and pGL3-RGC32-2was significantly lower than that of pGL3-RGC32-FL1 and pGL3-RGC32-1, respectively. These results suggest that MZF1 may bind to the -286nt -86 NT region of the RGC32 gene promoter. Conclusion: the full-length and truncated luciferase reporter plasmids of rat RGC32 gene promoter were successfully constructed. It was confirmed that overexpression of MZF1 could promote the initiation of RGC32 gene, and the possible binding region of transcription factor MZF1 on the promoter of RGC32 gene was preliminarily screened.
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)系;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31470853,81273333,81471626) 江蘇省自然科學(xué)基金面上項目(BK20131386)資助
【分類號】：R692.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2020380