發(fā)布時間：2018-05-09 08:47

  本文選題：KSper + 膜電位��； 參考：《南昌大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：受精過程中精子功能的調(diào)控被普遍認(rèn)為是精子成功授精的重要保障,離子通道是調(diào)控精子功能的重要因子。精子特異性KSper通道是哺乳動物精子上的主要K+通道,與精子運(yùn)動、膜超極化及頂體反應(yīng)等息息相關(guān)。首篇關(guān)于在體KSper電流的研究報道于2007年,他們發(fā)現(xiàn)在小鼠精子中,KSper是一種強(qiáng)pH敏感、電壓依賴的鉀離子通道。隨后,通過對基因敲除鼠的研究,小鼠KSper被認(rèn)為是由mSlo3介導(dǎo),且雄性Slo3-/-小鼠表現(xiàn)出不育性,表明KSper通道對雄性生殖起著不可缺少的作用。人精子中同樣能夠記錄到KSper電流,但由于其特性與小鼠KSper存在差異性,目前對于人KSper通道仍存在較大爭議性。一部分人認(rèn)為與小鼠KSper相比,人KSper通道對pH不敏感而能夠被胞內(nèi)Ca2+激活,此特性與Slo1通道(BK通道)特性相似;另一部分人則發(fā)現(xiàn)在體人KSper電流既能夠被Ca2+激活,又對pH呈現(xiàn)弱敏感性,人KSper通道與小鼠KSper通道呈現(xiàn)不同特性源自通道的種屬差異性;還有一部分人通過藥理學(xué)實(shí)驗證明,人KSper通道擁有Slo1與Slo3雙重通道藥理學(xué)特性,而并未就通道自身特性做出闡述。由此可見,人KSper通道特性仍未有一個清晰的定論,pH與Ca2+對人KSper通道究竟是怎樣的調(diào)節(jié)機(jī)制,pH與Ca2+在通道的調(diào)節(jié)中獨(dú)自的貢獻(xiàn)有多少,二者對通道的調(diào)控是否有相互協(xié)調(diào)效應(yīng)?因此,闡明該通道的生理特性是本論文需要解答的主要問題之一。借助于對Slo3敲除鼠的研究,有報道發(fā)現(xiàn),Slo3-/-精子表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動能力、頂體反應(yīng)及滲透壓調(diào)節(jié)等功能的異常,表明KSper通道參與調(diào)控精子功能,但該通道在哺乳動物中具體的生理病理功能仍不清楚。哺乳動物KSper通道能否感受胞外生理、病理物質(zhì)變化,作為該類物質(zhì)的靶點(diǎn),從而調(diào)節(jié)精子功能仍是未知數(shù)。近年來,環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對雄性生殖系統(tǒng)的影響引起越來越多的關(guān)注。雙酚A(BPA)作為一種雌激素類似物,被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、生活用品及醫(yī)療器械中。雙酚A被多次報道能夠引起雄性小鼠及人多種生殖問題,如導(dǎo)致雄性小鼠生殖器官異常、降低生精數(shù)量及精子運(yùn)動,降低人精子前向運(yùn)動等。且另有研究發(fā)現(xiàn),BPA能夠作用于同屬Slo家族的BK通道,改變通道特性,基于此,我們推測BPA對精子功能的影響有可能是通過作用于KSper通道發(fā)揮作用。因此,闡明KSper通道能否作為胞外因子作用的靶點(diǎn)并調(diào)控精子功能是本論文研究的第二個問題。本論文基于對以上兩個問題的思考,以人成熟精子為研究對象,通過精子膜片鉗技術(shù)、免疫共沉淀、鈣信號測量等實(shí)驗技術(shù),闡明人精子KSper通道特性;以小鼠及人成熟精子為研究對象,通過精子膜片鉗技術(shù)、RT-PCR、免疫蛋白印跡、計算機(jī)輔助精液分析(CASA)、體外頂體反應(yīng)染色檢測等體外實(shí)驗技術(shù)方法和在體喂養(yǎng)小鼠BPA后檢測精子功能及通道影響等手段擬對KSper通道作為胞外因子的靶點(diǎn)調(diào)控精子功能做出基礎(chǔ)探索,嘗試對以上問題進(jìn)行初步解答。通過本文的相關(guān)研究我們發(fā)現(xiàn)如下結(jié)果:1)pH與Ca2+皆參與調(diào)控人精子KSper通道,二者對于膜超極化均有獨(dú)立貢獻(xiàn);2)pH與Ca2+對人KSper通道的調(diào)控存在共享途徑,二者共同誘導(dǎo)的膜超極化幅度小于單獨(dú)誘導(dǎo)的超極化幅度之和;3)不同鈣源激活KSper的效率存在顯著差異,究其原因是人KSper通道與CatSper通道存在結(jié)構(gòu)空間上的共定位及功能上的耦聯(lián),這可能使得由CatSper介導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)的Ca2+更易在通道復(fù)合物處富集,造成局部的高鈣環(huán)境,從而更敏感、更高效地調(diào)控KSper通道;4)CatSper通道而非KSper通道作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物BPA的靶點(diǎn),影響小鼠精子功能;5)BPA能夠顯著抑制人成熟精子功能,但不作用于KSper及CatSper通道;6)男性不育與KSper通道異常存在一定的相關(guān)性。綜合以上結(jié)果,我們得出以下結(jié)論:人KSper通道受生理因子pH與Ca2+的雙重調(diào)控;小鼠CatSper通道可作為環(huán)境毒理因子作用的靶點(diǎn),介導(dǎo)內(nèi)分泌干擾物BPA對小鼠精子功能的影響;男性不育與KSper通道異常存在一定的相關(guān)性。
[Abstract]:The regulation of sperm function in the process of fertilization is generally considered to be an important guarantee for sperm's successful fertilization. Ionic channel is an important factor in regulating sperm function. Sperm specific KSper channel is the main K+ channel on mammalian sperm, which is closely related to sperm motility, membrane hyperpolarization and acrosome reaction. The first Research on the current in the body of KSper In 2007, they found that KSper was a strong pH sensitive, voltage dependent potassium channel in mouse sperm. Then, through the study of gene knockout mice, mouse KSper was thought to be mediated by mSlo3, and male Slo3-/- mice showed sterility, indicating that KSper channels played an indispensable role in male reproduction. Human spermatozoa In the same way, KSper current can be recorded, but because its characteristics are different from the mouse KSper, there is still much controversy about the human KSper channel. Some people think that the human KSper channel is not sensitive to the pH and can be activated by the intracellular Ca2+ compared with the mouse KSper, which is similar to the Slo1 channel (BK channel) characteristics; the other part is the same. The current human KSper current can be activated by Ca2+ and weak sensitivity to pH. The difference characteristics of the human KSper channel and the mouse KSper channel are different from the channel, and some people have proved that the KSper channel has the dual channel pharmacological properties of Slo1 and Slo3 through the pharmacological experiments, and does not make the characteristics of the channel itself. It can be seen that the characteristics of the human KSper channel still have no clear conclusion, what is the regulation mechanism of pH and Ca2+ on human KSper channel, how much contribution of pH and Ca2+ to the channel regulation, and whether there is a coordination effect on the regulation of the two channels? Therefore, it is necessary to explain the physiological characteristics of the channel. One of the main problems. With the help of the study of Slo3 knockout mice, it is reported that Slo3-/- spermatozoa showed obvious motor ability, abnormality of acrosome reaction and osmotic pressure regulation, indicating that the KSper channel participates in the regulation of sperm function, but the specific physiological and pathological function of this channel in mammals is still unclear. Mammalian KSper channel. In recent years, the effects of environmental endocrine disruptors on male reproductive systems have attracted more and more attention. Bisphenol A (BPA), as a kind of estrogen analogues, is widely used in industry, daily necessities and medical devices. In a number of reports, bisphenol A can cause multiple reproductive problems in male mice and people, such as abnormal reproductive organs in male mice, reducing spermatogenesis and sperm motility, and reducing human sperm forward movement. Furthermore, BPA can act on the BK channel of the same Slo family and change the characteristics of the channel. Based on this, we speculate that BPA is to spermatozoon. The effect of subfunction is likely to play a role in the KSper channel. Therefore, it is the second problem to clarify whether the KSper channel can be used as a target for the extracellular factor and to regulate the function of sperm. This paper is based on the thinking of the above two problems, and the sperm patch clamp technique is used in the study of human mature spermatozoa. Immunoprecipitation and calcium signal measurement were used to elucidate the characteristics of KSper channel in human sperm. Taking mouse and human spermatozoa as the research object, sperm patch clamp technique, RT-PCR, immunoblotting, computer assisted semen analysis (CASA), in vitro acrosome staining in vitro, and in vivo feeding mice BPA were examined. The function of spermatozoon and the influence of the channel are designed to make basic exploration on the regulation of sperm function as the target of KSper channel as an extracellular factor. We try to make a preliminary answer to the above problems. Through this study we found the following results: 1) both pH and Ca2+ are involved in the regulation of human sperm KSper channel, and the two have independent tribute to membrane hyperpolarization. 2) 2) there is a sharing route between pH and Ca2+ for the regulation of human KSper channel. The two co induced membrane hyperpolarization amplitude is less than the sum of the single induced hyperpolarization amplitude; 3) the efficiency of KSper activation by different calcium sources is significantly different. The reason is the co location and functional coupling of the KSper channel and CatSper channel in the structure space. It may make CatSper mediated into the intracellular Ca2+ more easily enriched in the channel complex, resulting in a local high calcium environment, thus more sensitive and more efficient in regulating the KSper channel; 4) CatSper channel, not KSper channel as a target for environmental endocrine disrupting BPA, affects mouse sperm function; 5) BPA can significantly inhibit the function of human sperm. But it does not play a role in KSper and CatSper channels; 6) there is a certain correlation between male infertility and abnormal KSper channel. Combining the above results, we conclude that the human KSper channel is regulated by the dual physiological factors of pH and Ca2+, and the CatSper channel in mice can be used as a target for environmental toxicological factors and mediates the endocrine disruptor BPA to the sperm of mice. There is a certain correlation between male infertility and KSper channel abnormalities.

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R698.2

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本文編號：1865352