發(fā)布時(shí)間：2018-04-10 20:56

  本文選題：精漿 + miRNAs��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的:在優(yōu)化人精漿miRNAs提純方法的基礎(chǔ)上,研究不同類型男性不育癥患者精漿miR-106b的表達(dá)變化,探索miR-106b作為診斷男性不育分子靶標(biāo)的可能性;并且以不同發(fā)育時(shí)期的小鼠睪丸,小鼠精原細(xì)胞(GC-1)和精母細(xì)胞(GC-2)細(xì)胞系為材料,研究miR-106b對(duì)生精細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制。研究方法:1.優(yōu)化及驗(yàn)證人精漿miRNAs提純方法:收集國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科研所生殖健康服務(wù)中心就診者精液樣本。根據(jù)不同RNA提取方法分為4組:Trizol LS組、蛋白酶 K+Trizol LS 組、miRNeasy Micro kit 組及 Trizol LS+miRNeasy Micro kit聯(lián)合使用組(改良組)。比較4組提純精漿RNA的OD260/280,使用Agilent2100生物分析儀檢測(cè)改良法提純精漿miRNA的純度和質(zhì)量,比較4組Real-time PCR檢測(cè)精漿miR-106b和miR-9表達(dá)豐度的溶解曲線。2.miR-106b在男性不育癥患者精漿中的表達(dá)變化:收集國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科研所生殖健康服務(wù)中心的正常精漿樣本(精液常規(guī)檢查參數(shù)正常且一年內(nèi)配偶懷孕并正常分娩)15例,非梗阻性無精子癥精漿樣本(臨床確診)30例,弱精子癥精漿樣本(臨床確診)10例。Real-time PCR檢測(cè)正常組(n=5)、非梗阻性無精子癥組(n=10)miR-106b的表達(dá)量,結(jié)果顯示有顯著差異,進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,正常組(n=10)、非梗阻性無精子癥組(n=20)并添加弱精子癥組(n=10)檢測(cè)miR-106b的表達(dá)量。3.mmiR-106b對(duì)生精細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制:(1)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在不同發(fā)育時(shí)期(7d,14d,21d,35d,64d)小鼠睪丸組織中表達(dá)水平。(2)慢病毒包裝miR-106bmimics(模擬物),miR-106b inhibitor(抑制物),miR-106b mimics control(模擬物對(duì)照)和miR-106binhibitorcontrol(抑制物對(duì)照),感染GC-1、GC-2,通過共聚焦顯微鏡和Real-time PCR檢測(cè)及鑒定穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。MTS法檢測(cè)感染慢病毒后GC-1、GC-2的增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-106b對(duì)GC-1、GC-2凋亡及細(xì)胞周期的影響。(3)通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)miR-106b可能的靶基因,篩選與生精細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因,Real-time PCR檢測(cè)其在上述慢病毒感染的各細(xì)胞株中的表達(dá)變化,比較其與miR-106b的表達(dá)趨勢(shì),初步判斷其為miR-106b靶基因的可能性。研究結(jié)果:1.(1)改良組提純的精漿RNA OD 260/280為(1.90±0.03)顯著高于其它三組(p0.05)。(2)改良組提純的miRNA通過Agilent 2100生物分析系統(tǒng)檢測(cè),色譜圖位置特異性明顯,峰值清晰,質(zhì)量合格,能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。(3)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b顯示,以前三組為模板的溶解峰不單一,非特異性擴(kuò)增明顯,改良組的溶解曲線標(biāo)準(zhǔn),峰型窄而尖。Real-time PCR檢測(cè)miR-9顯示,前兩組方法峰型不單一,具有非特異性擴(kuò)增,第三組雖具有單一峰型,但上升曲線相較于改良組,不夠平滑。2.小樣本Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在精液參數(shù)正常精漿樣本和非梗阻性無精子癥患者精漿中的表達(dá)豐度,結(jié)果顯示miR-106b在非梗阻性無精子癥患者精漿樣本中表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照(P0.01),擴(kuò)大樣本量檢測(cè)精液參數(shù)正常精漿樣本(n=10)、非梗阻性無精子癥精漿樣本(n=20)和弱精子癥精漿樣本(n=10)中miR-106b的表達(dá)豐度,結(jié)果顯示miR-106b在非梗阻性無精子癥組及弱精子癥組的表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照組(P0.01),在弱精子癥樣本中的表達(dá)量顯著高于非梗阻性無精子癥(P0.05)。3.(1)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在不同發(fā)育時(shí)期小鼠睪丸組織中表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)第7天時(shí)miR-106b的表達(dá)量最高,從7～35天,miR-106b的表達(dá)量隨著小鼠睪丸的發(fā)育呈逐漸降低的趨勢(shì)(P0.01),35天與64天相比,小鼠睪丸組織中miR-106b的表達(dá)量無顯著變化。(2)慢病毒感染GC-1、GC-2后,共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度很強(qiáng),感染率高達(dá)85%。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示慢病毒感染后GC-1、GC-2中miR-106b mimics組與miR-106b mimics control 組相比,表達(dá)量顯著升高(P0.01),miR-106b inhibitor 組與 miR-106b inhibitor control 組相比,表達(dá)量顯著降低(P0.01)。(3)在GC-1、GC-2中,miR-106b mimic組與其對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而miR-106b inhibitor組的趨勢(shì)正好和miR-106b mimics組相反,抑制miR-106b表達(dá)后,GC-1、GC-2的細(xì)胞增殖能力均有所減弱(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明miR-106b具有促進(jìn)生精細(xì)胞增殖的作用。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:在GC-1、GC-2中,miR-106bmimics組與其對(duì)照組相比,細(xì)胞凋亡率顯著降低,miR-106b inhibitor與其對(duì)照相比,細(xì)胞凋亡率顯著升高,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明miR-106b具有抑制生精細(xì)胞凋亡的作用;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,慢病毒感染 GC-1、GC-2 后,miR-106b mimics 組比 miR-106b inhibitor 組在 G0/G1 期細(xì)胞百分比顯著降低、S期細(xì)胞百分比顯著升高(P0.05)。(5)靶基因預(yù)測(cè)及Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示,GC-1、GC-2 中,STAT3 在 miR-106b mimics 組中的表達(dá)量顯著低于其對(duì)照組(P0.01),miR-106b inhibitor組與其對(duì)照相比,STAT3的表達(dá)量在GC-1中差異不顯著,在GC-2中,STAT3在miR-106b inhibitor組中的表達(dá)量顯著高于其對(duì)照組(P0.1);在GC-1和GC-2中,SOCS3在miR-106b mimics組中的表達(dá)量均顯著低于其對(duì)照組(P0.05),而miR-106b inhibitor組與其對(duì)照相比,SOCS3的表達(dá)量在GC-1中差異不明顯,在GC-2中,SOCS3在miR-106binhibitor組中的表達(dá)量顯著高于其對(duì)照組(P0.05);在GC-1中,miR-106b mimics組與其對(duì)照組相比,SMAD5的表達(dá)量具有下降趨勢(shì),miR-106b inhibitor組與其對(duì)照組相比,SMAD5的表達(dá)量有所升高,但是差異不顯著(P0.05),而在GC-2中,miR-106b mimics組與其對(duì)照組相比SMAD5的表達(dá)量上升,而在miR-106b inhibitor組及其對(duì)照組中SMAD5的表達(dá)量均低于miR-106b mimics組及其對(duì)照組,差異不顯著(P0.05)。結(jié)論:1.Trizol LS+miRNeasy Micro kit聯(lián)合使用法(改良法)提純的精漿miRNA質(zhì)量好,能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。2.miR-106b在非梗阻性無精子癥及弱精子癥患者精漿中表達(dá)豐度顯著低于正常對(duì)照組;弱精子癥組中miR-106b的表達(dá)量顯著高于非梗阻性無精子癥組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.從出生后7天到35天的小鼠睪丸中,miR-106b的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì),35天后表達(dá)量趨于平穩(wěn)。miR-106b能夠促進(jìn)GC-1、GC-2細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,具有促進(jìn)其細(xì)胞周期由G1期向S期過渡的趨勢(shì),抑制miR-106b的表達(dá)會(huì)引起GC-1、GC-2細(xì)胞周期阻滯在G1期。預(yù)測(cè)的靶基因STAT3、SOCS3與miR-106b的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系,初步判斷其可能是miR-106b在生精細(xì)胞中的靶基因,但尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R698.2

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本文編號(hào)：1732885