本文選題：腎母細(xì)胞瘤　切入點(diǎn)：蛋白質(zhì)標(biāo)記物　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：1研究背景與研究目的腎母細(xì)胞瘤是小兒泌尿系統(tǒng)最常見的惡性實(shí)體腫瘤。腎母細(xì)胞瘤是原發(fā)性腎臟惡性腫瘤,由于一些原始的腎胚胎細(xì)胞在發(fā)生的進(jìn)程中出現(xiàn)了基因調(diào)控的異常,進(jìn)而使細(xì)胞分化成熟出現(xiàn)障礙,導(dǎo)致了細(xì)胞異常增殖分裂而不受控制。在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中,經(jīng)�？梢钥吹皆嫉哪I小管和腎小球。大約75%的病例發(fā)生在5歲以內(nèi)的兒童,尤其多見于2~4歲的幼兒。腎母細(xì)胞瘤約93%為單側(cè)發(fā)病,大約10%的患兒為雙側(cè)發(fā)病,左右兩側(cè)的發(fā)病率大致相近,同時(shí)或者相繼發(fā)生。發(fā)病率在男女性別上幾乎沒有差異,但是在大部分的病例報(bào)告中,男性患者發(fā)病率稍多于女性,也有極少病例發(fā)生于成人。腎母細(xì)胞瘤瘤體體積比較大,邊界分布清楚,部分腫瘤也可有假膜形成。腎母細(xì)胞瘤的切面顏色灰白,切面多呈爛魚肉樣,腫瘤質(zhì)地比較柔軟,大部分伴有出血和壞死等,也可見骨樣組織的出現(xiàn)。目前早期診斷、病理分型以及恰當(dāng)?shù)闹委煼绞绞怯绊懟純侯A(yù)后的主要因素。目前,腎母細(xì)胞瘤的診斷主要依據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)結(jié)合超聲,靜脈尿路照影,CT等手段。對(duì)于腎母細(xì)胞瘤I或II期的患兒,主要還是以手術(shù)治療或化療為主;而對(duì)于晚期病例則需要擴(kuò)大治療,輔以化療,甚至放療。多數(shù)病例雖然得以確診,卻因不能早期診斷,貽誤最佳治療時(shí)機(jī)而影響預(yù)后。目前,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日趨成熟,為惡性腫瘤的相關(guān)研究提供了新的思路。如今應(yīng)用最廣泛的蛋白組學(xué)技術(shù)是表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù),蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用是其核心技術(shù),它的主要特點(diǎn)就是可以從生物和臨床樣品中快速提供蛋白質(zhì)表達(dá)譜的能力。腫瘤標(biāo)志物既能夠作為患者早期診斷的有力證據(jù),又能夠作為后期療效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在本課題組前期的研究過程中,我們已經(jīng)通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定了腎母細(xì)胞瘤血清中的腫瘤標(biāo)志物,但是,腎母細(xì)胞瘤瘤體組織中是否存在與血清中類似的蛋白質(zhì)標(biāo)記物尚不清楚。另外,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)階段,炎癥也起到一定的推動(dòng)作用,在腫瘤患者的血清中,可以檢測(cè)到某些炎癥因子的參與,其可能干擾腫瘤的診斷和監(jiān)測(cè)。所以,在篩選和鑒定腫瘤標(biāo)志物過程中,有必要剔除炎癥因子的干擾。另外僅僅排除和腫瘤相關(guān)的炎癥因子也不足以排除炎癥因子的干擾,本研究選取SIRS患兒血清作為對(duì)照組,擴(kuò)大剔除的炎癥因子范圍。全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS):是因?yàn)闄C(jī)體受到感染或非感染的病因,導(dǎo)致機(jī)體自我持續(xù)放大和自我破壞的而失控的全身性炎癥反應(yīng)。全身炎癥反應(yīng)綜合征是機(jī)體在修復(fù)和生存的過程中出現(xiàn)過度的應(yīng)激反應(yīng)的一種臨床過程。與此同時(shí),機(jī)體和組織會(huì)釋放大量的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子,在病人的血液循環(huán)中早期可以發(fā)現(xiàn)如IL-1,TNF,MIP;接著會(huì)發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子,中性細(xì)胞脫顆粒物,補(bǔ)體片段,花生四烯酸衍生物,還有多種趨化因子。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤患兒血清,健康對(duì)照組血清,同時(shí)與重癥感染患兒對(duì)照組血清進(jìn)行對(duì)比,最大程度剔除炎癥因子的干擾,篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化,并用二維液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜(2D-LC-LTQ-MS)聯(lián)用系統(tǒng)技術(shù)對(duì)篩選出的特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定,以期與前期的研究結(jié)果相契合。同時(shí),為了驗(yàn)證在腎母細(xì)胞瘤瘤體組織中是否存在相似的非炎癥性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,本研究通過表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤患兒瘤體組織總蛋白,正常腎組織總蛋白,同時(shí)與重癥感染患兒對(duì)照組血清進(jìn)行對(duì)比,剔除炎癥因子的干擾,篩選出特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(TRICINESDS-PAGE)技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化,收集目標(biāo)蛋白。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)技術(shù)鑒定目標(biāo)蛋白。所以,本研究的目的就是最大程度排除炎癥因子的干擾,篩選和鑒定腎母細(xì)胞瘤血清及其瘤體組織中特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1臨床病例資料本研究收集170例血清和85例組織標(biāo)本均從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院獲得。其中腎母細(xì)胞瘤組血清50例,平均年齡2.9±0.1歲,男性28例,女性22例;正常對(duì)照組血清60例,平均年齡3.2±0.1歲,男性34例,女性26例;SIRS對(duì)照組60例,平均年齡3.1±0.1歲,男性37例,女性23例。外周靜脈血標(biāo)本均抽取于患兒清晨空腹時(shí),室溫下靜置1h,3000r/min離心10min,收集血清樣本,儲(chǔ)存于-80℃冰箱,保存?zhèn)溆�。收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年至2013年腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)后瘤體組織45例,其中男性23例,女性22例,平均年齡2.8±0.1歲。收集患兒癌旁正常腎組織40例(根治性手術(shù)31例,姑息性切除9例)作為正常對(duì)照組,男性22例,女性18例,平均年齡2.9±0.1歲。正常對(duì)照組,SIRS對(duì)照組與腎母細(xì)胞瘤組年齡、性別相匹配。相關(guān)結(jié)果得到2位以上的病理學(xué)專家證實(shí)經(jīng)手術(shù)及組織穿刺活檢病理診斷為腎母細(xì)胞瘤。收集的組織樣本,儲(chǔ)存于-80℃冰箱,保存?zhèn)溆�。本�?shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)同意,且受試者均簽署有知情同意書。2.1.2主要試劑及儀器尿素、Na AC、芥子酸(SPA)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)和胰蛋白酶均來自美國(guó)Promega公司。SELDI-TOF-MS、Ciphergen PBS II和WCX2蛋白質(zhì)芯片均來自美國(guó)Ciphergen公司。胰島素、細(xì)胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、乙腈、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、NH4HCO均來自美國(guó)Sigma公司。RNeasy Plus Micro Kit試劑盒、RNAprep pure Tissue Kit購(gòu)自北京Qiagen公司。PBS II+型SELDI-TOF-MS和Bio-processor:弱陽(yáng)離子交換芯片(WCX2)蛋白質(zhì)芯片工作平臺(tái)均來自于美國(guó)Ciphergen Biosystem公司;HPLC來自于日本Shimadzu公司,其中C18(250*4.6mm)色譜柱來自于德國(guó)Sunchrom公司;MALDI-TOF/TOF-MS系統(tǒng)來自于德國(guó)Bio Rad公司;2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)來自于美國(guó)Thermo Electron公司。2.2實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1組織總蛋白的提取以下操作均在冰上進(jìn)行:1.將低溫保存的組織樣本進(jìn)行稱重。2.加入細(xì)胞裂2材料與方法 2.1實(shí)驗(yàn)材料解液。組織樣本與細(xì)胞裂解液比例一般為100mg:500μl,然后加入蛋白酶抑制劑2ul。3.用組織勻漿器把腫瘤組織勻漿,至無明顯肉眼可見固體。4.將組織勻漿吸入另外一個(gè)預(yù)冷的干凈離心管內(nèi),4℃14000g/min離心25~30mins。5.最后將上清液轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的干凈離心管,即可得到總蛋白。上述蛋白提取物分裝后,標(biāo)記清楚于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.2腎母細(xì)胞瘤血清及其瘤體組織中蛋白質(zhì)的篩選冰浴中解凍血清和瘤體組織總蛋白標(biāo)本,在4℃下10000r/min離心2min。將96孔板放置于冰盒上,然后,每孔加入5μl血清和瘤體組織總蛋白樣本,U9(9mol/L尿素),1%Bar,2%CHAPS10μl,在4℃層析柜中600r/min振蕩30min。在震蕩結(jié)束前留15 min進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片的預(yù)處理,將蛋白質(zhì)芯片裝入Bioprocessor加樣器中,記錄下蛋白質(zhì)芯片的號(hào)碼,每孔加入Na AC(100mmol/L,p H4)200μl,放入層析柜中600r/min振蕩2min,重復(fù)以上操作1次。經(jīng)過U9處理后的96孔板置于冰盒上,用排槍加入Na AC185μl,層析柜中4℃600r/min震蕩2min。取已處理的樣本100μl加到蛋白質(zhì)芯片上,置于層析柜中4℃600r/min結(jié)合1h,甩去殘液,快速拍干。然后加入Na AC200μl,600r/min振蕩5min后,甩去殘液,快速拍干,重復(fù)操作3次。接著用去離子水200μl沖洗各孔2次,甩干殘液。待蛋白質(zhì)芯片風(fēng)干后,每孔加入50%飽和的SPA 1μl,分兩次完成,干燥后即可上機(jī)待檢測(cè)。2.2.3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理質(zhì)譜分析的原始數(shù)據(jù)先經(jīng)過濾噪音和聚類分析處理,將初步篩選出的質(zhì)荷比峰值數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗(yàn)。初步篩選出的m/z峰值是分析數(shù)據(jù)的對(duì)像,隨后,需要將不同組別間的質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取α=0.01;腎母細(xì)胞瘤術(shù)前血清組、正常對(duì)照組血清、瘤體組織組、正常腎組織組及SIRS對(duì)照組血清間的差異性峰值進(jìn)行分析比對(duì),找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白(數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差),即聚類分析。其既與正常對(duì)照組存在特異性,又與炎性對(duì)照組存在特異性,再提出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子,這樣就在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)于篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾。2.2.4腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性標(biāo)記物的純化在實(shí)驗(yàn)前取出凍存于-80℃冰箱中的分裝的血清樣品,放置于冰盒上慢慢解凍。吸取血清樣品100μl,加入去離子水300μl和乙腈600μl,充分振蕩混勻后,放置于4℃下,以便使血清中的大分子蛋白得到充分沉淀。等待30min后取出樣品,在4℃的環(huán)境中,在10000rpm的轉(zhuǎn)速下離心30min。丟棄沉淀,收集上清液,將液體真空干燥濃縮至體積小于50μl,然后加入H2O/0.1%TFA450μl,充分振蕩混勻后,用自行裝填的C18固相萃取小柱對(duì)其進(jìn)行脫鹽。采用C18反相高壓液相色譜柱對(duì)經(jīng)上述處理后的血清樣品進(jìn)行分離。H2O/0.1%TFA為流動(dòng)相A,ACN/0.09%TFA為流動(dòng)相B。加注樣品前,先用流動(dòng)相B對(duì)色譜柱進(jìn)行活化15min,再用流動(dòng)相A對(duì)柱體平衡30min,然后通過自動(dòng)進(jìn)樣器上樣。洗脫步驟為:100%流動(dòng)相A和20-40%流動(dòng)相B梯度各15min,40-70%流動(dòng)相B梯度為50min,用100%流動(dòng)相B沖洗柱體10min。整個(gè)過程中流速設(shè)置為0.5 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為214nm、254nm和280nm。用離心管分別收集各峰組分,記錄好時(shí)間和順序,將收集樣品真空濃縮至體積小于20μl。對(duì)初步分離后的血清樣品和HPLC分離所得各組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS的線性模式檢測(cè)。2.2.5腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物的純化選取0.75mm的制膠玻璃,使下端邊緣對(duì)齊,用配套的玻璃夾夾緊,然后放置膠架上,將玻璃的下端與膠墊充分接觸,防止加入的制膠液體發(fā)生泄漏。先配制的分離膠加入至玻璃的2/3,再加入異丙醇使液面水平,靜置約1.0h-1.5h,待其凝固后吸干異丙醇,再加入配制的濃縮膠,選用配套的梳子小心插入,防止氣泡產(chǎn)生,再次靜置大約1.0h,等待膠體凝固,然后放入電泳槽,加入配制的電泳液,小心拔出梳子,準(zhǔn)備加入樣品。把前期去除大分子蛋白并濃縮后的組織總蛋白質(zhì)樣本加入指示劑5ul,在沸水中煮沸樣品10min,取出后再次5000r/min離心5min。取10ul上清液小心加至膠體梳子的齒槽中,第一泳道加入Marker,對(duì)應(yīng)相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子量,作為觀察標(biāo)尺,后面的泳道依次加入蛋白質(zhì)樣本,且應(yīng)詳細(xì)記錄。然后連接電泳儀,準(zhǔn)確正負(fù)極。在濃縮膠時(shí),電壓設(shè)定為30v,當(dāng)指示劑接近至濃縮膠與分離膠交界處時(shí),將電壓調(diào)到90v。大約5h小時(shí)后,指示劑接近分離膠膠體底部時(shí),關(guān)掉電泳儀,取出玻璃,小心分離濃縮膠和分離膠,防止破裂,把濃縮膠小心切除。然后,小心分離分離膠,放置到清潔的托盤中,倒入考馬斯亮藍(lán)染色劑,震蕩過夜,進(jìn)行染色。染色結(jié)束后,用去離子水清洗干凈,再加入脫色液,震蕩4-6小時(shí)進(jìn)行脫色,等待膠體顏色完全脫凈后,再用去離子水清洗干凈,最后在膠體上顯示出目標(biāo)藍(lán)色條帶。將膠體放置超凈工作臺(tái),帶上無菌口罩、帽子及手套,小心切下目標(biāo)蛋白質(zhì)目標(biāo)條帶,并將條帶切碎,分裝至不同EP管,做好標(biāo)記,分別記錄具體蛋白質(zhì)條帶信息,整個(gè)過程務(wù)必保證在冰面上進(jìn)行。然后對(duì)顯示的目標(biāo)條帶進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),最終確定膠體上目標(biāo)條帶。2.2.6腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物的鑒定取對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品20μl,然后加入60μl 8M尿素,使其最終濃度為6M,室溫振蕩20min使其充分溶解;再加入0.8μl 1M DTT,使其最終濃度為10m M,室溫放置1h;然后加入3.2μl 1M IAM,使其最終濃度為40m M,避光放置45min;再加入3.2μl 1M DTT,使其最終濃度為40m M,室溫放置30min;最后加入400μl 50m M NH4HCO3以稀釋樣品,將尿素最終濃度降到1M,p H值控制到大約為8.0。每份樣品中加入胰酶0.08μg,于37℃水浴下酶解過夜,然后加入0.2%TFA溶液,使樣品溶液p H值下降至6.0以下,以終止樣品酶解反應(yīng)。然后以12000g離心樣品溶液10min,吸取上清液,使其真空濃縮至體積小于10μl,再將樣品加入到C18蛋白質(zhì)樣品檢測(cè)的梯度洗脫柱中。將2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)的噴霧系統(tǒng)與加樣后的樣品柱和梯度洗脫柱相串聯(lián),進(jìn)行肽質(zhì)荷比圖譜的檢測(cè)。最后,將檢測(cè)結(jié)果錄入SEQUEST檢索程序,在Bioworks數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與檢測(cè)結(jié)果肽段及氨基酸相匹配的可能蛋白質(zhì)。2.2.7腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物的鑒定在對(duì)應(yīng)EP管中加入wash buffer80ul,37℃震蕩蛋白質(zhì)樣品20min,吸取洗脫液,加入新的wash buffer,重復(fù)操作三次,直到膠體的藍(lán)色洗去,接近白色透明狀。然后將膠體放入振蕩器,溫度升至90℃,膠體干燥15min。然后加入Digest Buffer20ul和稀釋的Reducing agent2 ul,將其充分混勻。然后,37℃水浴10 min。離開水浴后,使其溫度自然降至室溫,加入Blocking agent2ul,充分混勻。在室溫中靜置10min。然后加入稀釋的胰蛋白酶0.5ul,充分混勻,使最終胰蛋白酶的濃度達(dá)到8ng/ul。務(wù)必確保使膠體完全沉浸在液體中,5000r/min離心5min。37℃振蕩12-14h過夜。最后,放入離心機(jī),10000r/min離心10-15min,小心將上清液移至新的EP管中,同時(shí)在管壁上做好標(biāo)記,書面記錄。在蛋白芯片板靶環(huán)上加入1ul酶解樣本,室溫干燥后加入1ul基質(zhì),先對(duì)MALDI-TOF/TOF經(jīng)過校正后,然后經(jīng)激光解吸電離,收集到相應(yīng)的肽段質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過Mascot搜索軟件,再與Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)連接,搜索相匹配的蛋白質(zhì)。2.2.8 RT-PCR驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的基因表達(dá)使用RNAprep pure Tissue Kit提取腫瘤組和正常組組織中的RNA,使用Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit以RNA為模板合成first-strand c DNA。在Real-time PCR過程中使用Scientific Maxima SYBR Green q PCR Master Mixes檢測(cè)腫瘤組和正常組的first-strand c DNA擴(kuò)增情況,分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。PCR過程中目標(biāo)蛋白Profilin-1的引物:Forward 5′-ACGCCTACATCGACAACCTC-3′;Reverse 5′-TGATGTTGACGAACGTTTTCC-3′。PCR過程中目標(biāo)蛋白Ubiquitin的引物:Forward 5'-GTCACTAAGCCATCGGTCGT-3';Reverse 5'-ACACGGACA CAACCAGTTCA-3'。PCR反應(yīng)使用兩步法:50℃UDG預(yù)處理2min,95℃預(yù)變性10min;擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)的組成為95℃變性15sec、60℃引物退火30sec、72℃引物延伸30sec。使用Molecular Analyst software軟件分析PCR聚合物,使用標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算目標(biāo)蛋白基因?qū)τ讦?actin的比值。2.2.9 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物在血清中的表達(dá)使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay(ELISA)檢測(cè)腫瘤組血清和正常組血清中的APOC-I蛋白質(zhì)表達(dá)情況。首先配制0pg/ml,62.5pg/ml,125pg/ml,250pg/ml,500pg/ml,1000pg/ml,2000pg/ml和4000 pg/ml的APOC-I凍干標(biāo)準(zhǔn)品各100μL,然后加入預(yù)包被抗人APOC-I抗體的96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;腫瘤組血清和正常組血清蛋白樣品各取10個(gè),稀釋100倍后,每孔按100μL加入預(yù)包被抗人APOC-I抗體的96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,孵育酶標(biāo)板。吸去各孔液體后,加入100μL生物素標(biāo)記的抗人APOC-I抗體,孵育酶標(biāo)板;洗板后,加入ABC工作液,孵育酶標(biāo)板;洗板后,每孔加入TMB顯色液90μL,孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀調(diào)整到450nm,讀出各孔吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。2.2.10 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的表達(dá)使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay(ELISA)檢測(cè)腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)表達(dá)情況。首先配制0pg/ml,62.5pg/ml,125pg/ml,250pg/ml,500pg/ml,1000pg/ml,2000pg/ml和4000 pg/ml的Ubiquitin和Profilin-1凍干標(biāo)準(zhǔn)品各100μL加入預(yù)包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;腫瘤組和正常組組織總蛋白樣品各取10個(gè),稀釋100倍后,每孔按100μL加入預(yù)包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,孵育酶標(biāo)板。吸去各孔液體后,加入100μL生物素標(biāo)記的抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體,孵育酶標(biāo)板;洗板后,加入ABC工作液,孵育酶標(biāo)板;洗板后,每孔加入TMB顯色液90μL,孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應(yīng)。酶標(biāo)儀調(diào)整到450nm,讀出各孔吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。3結(jié)果 3.1腎母細(xì)胞瘤血清標(biāo)記物的篩選通過SELDI-TOF-MS對(duì)預(yù)處理的腎母細(xì)胞瘤患兒血清、健康對(duì)照組血清和重癥感染患兒血清檢測(cè)后,得到一系列蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)和炎癥因子峰值及其分解的肽段峰值。這些蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)按照病例組、正常對(duì)照組及炎癥對(duì)照組進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(P0.01),將差異性蛋白質(zhì)峰值篩選出來。其中:病例組血清與正常對(duì)照組血清中篩選出37個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值,35個(gè)蛋白質(zhì)峰值在正常對(duì)照組中高表達(dá),2個(gè)蛋白質(zhì)峰值在病例組中高表達(dá);病例組血清與炎癥對(duì)照組血清中篩選出27個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值。將以上兩組差異性蛋白進(jìn)行對(duì)比,找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白(數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差),篩出m/z位于6438Da的蛋白質(zhì)或肽段。其既與正常對(duì)照組存在特異性,又與炎性對(duì)照組存在特異性,再提出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子,在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾,確定了腎母細(xì)胞瘤非炎癥性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的m/z為6438Da。3.2腎母細(xì)胞瘤瘤體組織標(biāo)記物的篩選通過SELDI-TOF-MS預(yù)處理的腎母細(xì)胞瘤腫瘤組組織蛋白、正常對(duì)照組蛋白檢測(cè)后,得到一系列蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)及其分解的肽段峰值。這些蛋白質(zhì)峰值數(shù)據(jù)按照腫瘤組、正常對(duì)照組進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(P0.01),將差異性蛋白質(zhì)峰值篩選出來。其中,腫瘤組與正常對(duì)照組中篩選出50個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值,21個(gè)蛋白質(zhì)峰值在正常對(duì)照組中高表達(dá),29個(gè)蛋白質(zhì)峰值在腫瘤組中高表達(dá);腫瘤組組與炎癥對(duì)照組中篩選出50個(gè)差異性蛋白質(zhì)峰值。將以上兩組差異性蛋白進(jìn)行對(duì)比,找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白(數(shù)據(jù)結(jié)果存在0.3%偏差),篩出m/z位于8350Da和5363Da的蛋白質(zhì)或肽段。其既與正常對(duì)照組存在特異性,又與炎性對(duì)照組存在特異性,再提出與15種與腫瘤相關(guān)的炎性因子,在最大程度上排除了炎癥因子對(duì)篩選腎母細(xì)胞瘤特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾,得到m/z峰位于8350Da和5363Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物兩個(gè)。3.3腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性標(biāo)記物的純化及鑒定應(yīng)用HPLC法分離純化病例組血清樣本中的m/z為6438Da的特異性標(biāo)記物蛋白,同時(shí)將HPLC法得到的不同峰值的蛋白質(zhì)及肽段分裝并進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖找出m/z為6438Da(SELDI-TOF-MS結(jié)果存在0.3%的差異)蛋白質(zhì)或肽段樣品。將檢測(cè)出的m/z為6438Da的蛋白質(zhì)或肽段樣品分別酶解及通過2D-LC-LTQMS系統(tǒng)檢測(cè)肽段。m/z為6438 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為:E.LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK.G,通過將肽段導(dǎo)入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,此肽段為載脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)的一個(gè)肽段。最后利用SEQUEST檢索程序統(tǒng)計(jì)兩種肽段在其鑒定的目標(biāo)蛋白質(zhì)中的覆蓋率。3.4腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性標(biāo)記物的純化及鑒定通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離純化,根據(jù)Marker提供的參照標(biāo)尺,確定膠體上目標(biāo)條帶(圖3)。同時(shí)將目標(biāo)蛋白質(zhì)及肽段進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖(圖4)找出m/z為5363Da和8350Da(SELDI-TOF-MS結(jié)果存在0.3%的差異)蛋白質(zhì)或肽段樣品。根據(jù)Marker提供的參照標(biāo)尺,在對(duì)應(yīng)的分子量上,切除目標(biāo)條帶,酶解離心后,取上清液,利用MALDI-TOF/TOF平臺(tái)對(duì)得到肽段混合物并進(jìn)行檢測(cè)。m/z為5363 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為:K.IQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLS DYNIQKESTLHLVLRLR.G。通過將肽段導(dǎo)入Mascot檢索程序并在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,此肽段為泛素(Ubiquitin,UBIQ)的一個(gè)肽段。m/z為8350 Da的蛋白質(zhì)或肽段其序列為:K.DSPSVWAAVPGKTFVNITPAEVGVLVGKDRSSFYVN GLTLGGQKCSVIRDSLLQDGEFSMDLRTKSTGGAPTFNVTVK.T。通過將肽段導(dǎo)入Mascot檢索程序并在Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,此肽段為前纖維蛋白-1(Profilin-1,PFN1)的一個(gè)肽段。3.5 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性蛋白標(biāo)記物在血清中的表達(dá)我們使用ELISA對(duì)腫瘤組血清和正常組血清中的APO C-I蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。通過標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將待測(cè)樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的APO C-I蛋白質(zhì)的濃度,結(jié)果表明APO C-I在腫瘤組中低表達(dá),在正常組中高表達(dá)。3.6 RT-PCR驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的基因表達(dá)為了驗(yàn)證MALDI-TOF-TOF鑒定的目標(biāo)蛋白質(zhì)就是Ubiquitin和Profilin-1,我們使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)Ubiquitin和Profilin-1基因進(jìn)行檢測(cè),通過Real-time PCR分析表明,Ubiquitin基因在腫瘤組組織中低表達(dá),在正常組組織中高表達(dá);Profilin-1基因在腫瘤組組織中高表達(dá),在正常組組織中低表達(dá)。3.7 ELISA驗(yàn)證腎母細(xì)胞瘤體組織非炎癥性蛋白標(biāo)記物在組織中的表達(dá)我們使用ELISA對(duì)腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。通過標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線,將待測(cè)樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質(zhì)的濃度,結(jié)果表明Ubiquitin在腫瘤組組織中低表達(dá),在正常組組織中高表達(dá);Profilin-1在腫瘤組組織中高表達(dá),在正常組組織中低表達(dá)。4結(jié)論通過本研究證實(shí)了質(zhì)荷比為6438Da的蛋白質(zhì)或肽段為APO C-I,這種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在腎母細(xì)胞瘤患兒血清與正常組血清中均具有差異性,其結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果相契合;同時(shí),本研究證實(shí)了質(zhì)荷比5363Da和8350Da的蛋白質(zhì)或肽段為泛素和前纖維蛋白-1,這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在腎母細(xì)胞瘤患兒瘤體組織與正常組組織中均具有差異性,也證實(shí)了腎母細(xì)胞瘤血清與組織中沒有相同或相似的蛋白質(zhì)標(biāo)記物;并且在此次研究中最大程度的剔除了炎癥因子對(duì)尋找腎母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記物的干擾,使鑒定出的腎母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記物的蛋白質(zhì)更具有特異性。通過本課題的研究,不僅得到了特異性更強(qiáng)的腎母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)標(biāo)記物,更驗(yàn)證了通過新的實(shí)驗(yàn)思路和技術(shù)流程來鑒定腫瘤組織蛋白質(zhì)標(biāo)記物的可操作性,同時(shí)也為鑒定其他腫瘤的非炎癥性蛋白質(zhì)標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.11

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊春,王勇,史靜;小兒Ⅳ期腎母細(xì)胞瘤一例[J];河南腫瘤學(xué)雜志;2001年02期

2 余克涵,梅金紅,黃松,匡慶祿;成人腎母細(xì)胞瘤二例報(bào)告及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年05期

3 郭小林,楊為民,周惜才,葉章群;成人腎母細(xì)胞瘤的診斷與治療[J];臨床泌尿外科雜志;2001年11期

4 李斌,杜勇;成人腎母細(xì)胞瘤并多發(fā)結(jié)石1例[J];臨床泌尿外科雜志;2001年12期

5 任慶榮,馮紀(jì)祥;成人腎母細(xì)胞瘤5例報(bào)告[J];四川腫瘤防治;2001年03期

6 謝小志,王宗敏;葡萄狀腎母細(xì)胞瘤一例[J];溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

7 馬法仲,馮全森;少年腎母細(xì)胞瘤1例報(bào)告[J];實(shí)用放射學(xué)雜志;2002年09期

8 王禮泉,董瑋,王京濤,鄧進(jìn)巍,張衛(wèi)華;成人腎外腎母細(xì)胞瘤1例[J];中國(guó)腫瘤臨床;2002年06期

9 王子平,孫燕,林琳;11例成人腎母細(xì)胞瘤臨床治療分析[J];中國(guó)腫瘤臨床;2002年09期

10 陳方,劉國(guó)華,李衷初,蔡威,徐卯升,薛皓亮,謝華;腎母細(xì)胞瘤切除術(shù)中探查對(duì)側(cè)腎臟是必須的嗎?[J];中華小兒外科雜志;2002年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 劉志剛;耿玲玲;束玉萍;吳紅艷;何敏;;小兒腎母細(xì)胞瘤30例臨床診療分析[A];第八屆全國(guó)兒童腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

2 王勇;王兆陽(yáng);閆軍美;;小兒腎母細(xì)胞瘤的綜合治療(附20例報(bào)告)[A];第八屆全國(guó)兒童腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 翟欽;柴憶歡;周云;嚴(yán)向明;;腎母細(xì)胞瘤18例臨床分析[A];第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)班論文匯編[C];2009年

4 陸鵬;何大維;林濤;李旭良;魏光輝;劉俊宏;;小兒腎母細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的臨床診療分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

5 宋宏程;黃澄如;白繼武;孫寧;張濰平;田軍;謝向輝;李明磊;李寧;;腎母細(xì)胞瘤病(附5例病例分析)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)小兒外科學(xué)術(shù)會(huì)論文集[C];2010年

6 張小安;;腎母細(xì)胞瘤螺旋CT征象與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)間關(guān)系的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三屆全國(guó)放射學(xué)大會(huì)論文匯編（下冊(cè)）[C];2006年

7 張應(yīng)權(quán);安妮妮;何國(guó)慶;唐應(yīng)明;唐仕忠;范霞;劉迪;;小兒腎母細(xì)胞瘤的手術(shù)治療[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)第七屆全國(guó)小兒腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

8 壽建忠;李瑞乾;肖振東;肖澤均;田軍;王棟;畢新剛;管考鵬;魯力;韓蘇軍;石泓哲;趙欣;關(guān)有彥;馬建輝;李長(zhǎng)嶺;;成人腎母細(xì)胞瘤的臨床分析[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

9 倪雙雙;吳道珠;林益怡;;小兒腎母細(xì)胞瘤的超聲診斷價(jià)值[A];2008年浙江省超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

10 盛琦;張勤;袁曉軍;吳貽明;蔣馬偉;李玉華;;兒童晚期腎母細(xì)胞瘤的治療[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（下冊(cè)）[C];2012年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前9條

1 ;小兒腎母細(xì)胞瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及臨床意義[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年

2 陳錦屏 常保東 宋海霞;切除巨大腎母細(xì)胞瘤[N];健康報(bào);2006年

3 天津腫瘤醫(yī)院兒童腫瘤科 閆杰;洗澡時(shí)多摸摸孩子肚子[N];健康時(shí)報(bào);2008年

4 段文利 黃鐘明 郭毅;巨大腎母細(xì)胞瘤被切除[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

5 段文利 黃鐘明 郭毅;北京協(xié)和醫(yī)院成功切除成人巨大腎母細(xì)胞瘤[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

6 謝欣;幼女何以懷“怪胎”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2000年

7 劉永平邋岳麗穎;兒童腹部包塊要當(dāng)心[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2007年

8 葛秋芳;英國(guó)最新研究表明,干細(xì)胞療法可能引發(fā)癌癥[N];新華每日電訊;2007年

9 王炳輝;小兒癌癥如何治療[N];家庭醫(yī)生報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張謙;蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在小兒腎母細(xì)胞瘤臨床中的應(yīng)用研究[D];鄭州大學(xué);2010年

2 王政;小兒腎母細(xì)胞瘤免疫治療的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2007年

3 李凱;腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中端粒酶的表達(dá)和維生素A的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

4 牛之彬;促血管生成因子及其部分相關(guān)因子在腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

5 賈占奎;腎母細(xì)胞瘤血清標(biāo)記物的篩選與鑒定[D];鄭州大學(xué);2012年

6 王磊;腎母細(xì)胞瘤血清非炎癥性標(biāo)記物的篩選、鑒定及驗(yàn)證[D];鄭州大學(xué);2012年

7 郭鋒;Astrocyte elevated gene-1對(duì)腎母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2014年

8 張俊杰;腎母細(xì)胞瘤血清及瘤體組織剔除炎癥因子干擾后標(biāo)記物的篩選、鑒定及驗(yàn)證[D];鄭州大學(xué);2015年

9 何小偉;人腎母細(xì)胞瘤裸小鼠腎原位移植模型建立及維甲酸誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

10 陸良生;Wnt信號(hào)通路在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 盧海超;兒童復(fù)發(fā)性腎母細(xì)胞瘤臨床特點(diǎn)與治療的探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 陳新讓;腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物檢測(cè)與分期模型構(gòu)建研究[D];鄭州大學(xué);2007年

3 胡超;不同治療模式對(duì)小兒腎母細(xì)胞瘤預(yù)后的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2008年

4 鄭娜;促血管生成素2在小兒腎母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與血管生成關(guān)系的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2009年

5 田俊嚴(yán);腎母細(xì)胞瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和一氧化氮合酶表達(dá)與血管生成的關(guān)系及臨床意義[D];鄭州大學(xué);2002年

6 劉德忠;凋亡調(diào)控基因與小兒腎母細(xì)胞瘤多藥耐藥關(guān)系和意義[D];南昌大學(xué);2006年

7 張蛟;小兒腎母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物檢測(cè)及意義[D];鄭州大學(xué);2007年

8 張謙;抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)腎母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制[D];鄭州大學(xué);2004年

9 樊玉霞;血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物檢測(cè)在小兒腎母細(xì)胞瘤預(yù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[D];鄭州大學(xué);2007年

10 林隆;腎母細(xì)胞瘤介入治療后的病理學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：1642578