本文選題：MicroRNA　切入點(diǎn)：輻射敏感性　出處：《蘭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：前列腺癌是全球男性第二大常見癌癥,是男性癌癥死亡的第三大因素。目前,放射治療是一種最常見的、療效明確的局限性前列腺癌治療方法。但前列腺癌放射治療決不是無害的,其放射治療的腸、尿道副作用必須予以考慮。另外,有相當(dāng)多數(shù)的前列腺癌患者自首次接受放射治療后,后期存在局部輻射耐受和復(fù)發(fā)。因此,如何提高前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性、降低放射治療劑量、有效殺死腫瘤細(xì)胞、改善放射治療的療效仍是目前臨床醫(yī)生和科研工作者亟待解決的問題。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、非編碼小RNAs(約22nt),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在人類基因組中,目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定出了4000多條人源miRNAs,靶向至少60%的蛋白編碼基因。毫無疑問,miRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子,影響多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路,包括在電離輻射(Ionizing radiation,IR)誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response,DDR)中發(fā)揮重要作用。近年來,越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,miRNA參與腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性調(diào)控,可能成為一種新型的、臨床腫瘤放射治療的致敏靶分子。為了揭示miRNA在前列腺癌細(xì)胞應(yīng)答電離輻射中的表達(dá)變化及作用,闡明miRNA影響前列腺癌細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制,本論文首次采用人源miRNA芯片技術(shù)研究了不同LET的12C6+離子輻照后前列腺癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜變化,篩選出電離輻射后差異表達(dá)的miRNAs。隨后進(jìn)一步采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(q RT-PCR)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示:不同LET的12C6+離子和X-射線輻照處理LNCa P細(xì)胞24h后,miRNA的表達(dá)變化并不同,包括miR-17-92簇、miR-15/16家族、miR-34家族和let-7家族。在LNCa P細(xì)胞中,X-射線和30ke V/μm 12C6+離子輻照后24h,miR-17-92簇、miR-15/16家族miRNAs顯著上調(diào),而let-7和miR-34家族miRNAs表達(dá)下調(diào)。與X-射線輻照相比,70ke V/μm的12C6+離子輻照后引起更多的miRNAs表達(dá)變化,其中miR-17-92簇、miR-15/16家族的miRNAs表達(dá)顯著下調(diào),而let-7家族和miR-34家族miRNAs表達(dá)上升。值得關(guān)注的是,X-射線和不同LET的12C6+離II子輻照后,miR-449a表達(dá)均有上調(diào),采用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件Target Scan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)c-Myc是miR-449a的一個(gè)陽性靶基因。已有文獻(xiàn)報(bào)道,在各種人類惡性腫瘤中,包括前列腺癌,miR-449a表達(dá)下調(diào),而c-Mcy基因過表達(dá)。我們的q RT-PCR結(jié)果也顯示:與正常前列腺組織相比,miR-449a在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào),而c-Myc顯著過表達(dá)。在細(xì)胞應(yīng)答IR中,miR-449a在LNCa P細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá),而c-Myc表達(dá)被抑制。相關(guān)性分析表明,miR-449a與c-Myc表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。隨后,我們構(gòu)建了表達(dá)miR-449a的重組質(zhì)粒GV214-miR-449a和表達(dá)c-Myc 3′-UTR及c-Myc 3′-UTR突變的重組質(zhì)粒GV272-c-Myc 3′-UTR wt/mut。雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),在LNCa P細(xì)胞中miR-449a直接通過與c-Myc 3′-UTR相結(jié)合靶向抑制c-Myc表達(dá)。利用GV214-miR-449a轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCa P細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miR-449a增強(qiáng)IR誘導(dǎo)的細(xì)胞生長阻滯,提高LNCa P細(xì)胞對(duì)IR的敏感性。利用RNAi技術(shù),敲低c-Myc表達(dá)同樣增強(qiáng)LNCa P細(xì)胞的IR敏感性。這些研究結(jié)果說明:miR-449a可以通過靶向下調(diào)c-Myc表達(dá)來增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn):miR-449a增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞電離輻射敏感性的功能并不是廣泛的。在Rb野生型的LNCa P和PC-3細(xì)胞中過表達(dá)miR-449a,降低電離輻射后的細(xì)胞活性,增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制,最終使LNCa P和PC-3細(xì)胞對(duì)電離輻射敏感;但在Rb突變的DU-145細(xì)胞中過表達(dá)miR-449a,電離輻射后,細(xì)胞周期分布并無顯著性變化,細(xì)胞凋亡率增加也不明顯。通過分析前列腺癌細(xì)胞的分子生物學(xué)特征及采用WB分析發(fā)現(xiàn),LNCa P、PC-3和DU-145細(xì)胞有不同的p53和Rb蛋白表達(dá)狀態(tài)。一方面,LNCa P細(xì)胞表達(dá)野生型的p53、DU-145表達(dá)含有p53233leu和p53274phe兩種突變的p53,而PC-3細(xì)胞不表達(dá)任何p53蛋白,表現(xiàn)為p53缺失;另一方面,LNCa P和PC-3細(xì)胞表達(dá)野生型Rb蛋白,而DU-145細(xì)胞在Rb基因的21號(hào)外顯子缺失105bp的堿基對(duì),表達(dá)無活性的截短體RB蛋白。因此,推測(cè)miR-449a增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性可能與RB蛋白的狀態(tài)相關(guān)。進(jìn)一步采用WB分析檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)的信號(hào)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-449a/c-Myc增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性與CDC25A/RB/E2F1信號(hào)通路相關(guān)。一方面,miR-449a/c-Myc可通過抑制CDC25A/RB/E2F1信號(hào)通路及Cyclin B1/Cdc2周期相關(guān)蛋白增強(qiáng)電離輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯。另一方面,miR-449a/c-Myc也可通過下調(diào)凋亡靶基因Bcl-2的表達(dá),激活線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果為探討前列腺癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)理提供了新思路,考慮到miR-449a增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞輻射敏感性的潛能,本文的研究結(jié)果可為前列腺癌的放射治療提供一個(gè)新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.25

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本文編號(hào)：1640204