本文選題：MicroRNA　切入點：輻射敏感性　出處：《蘭州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：前列腺癌是全球男性第二大常見癌癥,是男性癌癥死亡的第三大因素。目前,放射治療是一種最常見的、療效明確的局限性前列腺癌治療方法。但前列腺癌放射治療決不是無害的,其放射治療的腸、尿道副作用必須予以考慮。另外,有相當多數(shù)的前列腺癌患者自首次接受放射治療后,后期存在局部輻射耐受和復發(fā)。因此,如何提高前列腺癌細胞的輻射敏感性、降低放射治療劑量、有效殺死腫瘤細胞、改善放射治療的療效仍是目前臨床醫(yī)生和科研工作者亟待解決的問題。MicroRNAs(miRNAs)是一類內源性、非編碼小RNAs(約22nt),在轉錄后水平調節(jié)基因表達。在人類基因組中,目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定出了4000多條人源miRNAs,靶向至少60%的蛋白編碼基因。毫無疑問,miRNA作為重要的基因表達調控因子,影響多個信號傳導通路,包括在電離輻射(Ionizing radiation,IR)誘導的DNA損傷應答(DNA damage response,DDR)中發(fā)揮重要作用。近年來,越來越多的實驗證據(jù)表明,miRNA參與腫瘤細胞的輻射敏感性調控,可能成為一種新型的、臨床腫瘤放射治療的致敏靶分子。為了揭示miRNA在前列腺癌細胞應答電離輻射中的表達變化及作用,闡明miRNA影響前列腺癌細胞輻射敏感性的分子機制,本論文首次采用人源miRNA芯片技術研究了不同LET的12C6+離子輻照后前列腺癌細胞中miRNA表達譜變化,篩選出電離輻射后差異表達的miRNAs。隨后進一步采用熒光定量反轉錄PCR(q RT-PCR)進行驗證。結果顯示:不同LET的12C6+離子和X-射線輻照處理LNCa P細胞24h后,miRNA的表達變化并不同,包括miR-17-92簇、miR-15/16家族、miR-34家族和let-7家族。在LNCa P細胞中,X-射線和30ke V/μm 12C6+離子輻照后24h,miR-17-92簇、miR-15/16家族miRNAs顯著上調,而let-7和miR-34家族miRNAs表達下調。與X-射線輻照相比,70ke V/μm的12C6+離子輻照后引起更多的miRNAs表達變化,其中miR-17-92簇、miR-15/16家族的miRNAs表達顯著下調,而let-7家族和miR-34家族miRNAs表達上升。值得關注的是,X-射線和不同LET的12C6+離II子輻照后,miR-449a表達均有上調,采用生物信息學在線預測軟件Target Scan預測發(fā)現(xiàn)c-Myc是miR-449a的一個陽性靶基因。已有文獻報道,在各種人類惡性腫瘤中,包括前列腺癌,miR-449a表達下調,而c-Mcy基因過表達。我們的q RT-PCR結果也顯示:與正常前列腺組織相比,miR-449a在前列腺癌組織中表達下調,而c-Myc顯著過表達。在細胞應答IR中,miR-449a在LNCa P細胞中被誘導表達,而c-Myc表達被抑制。相關性分析表明,miR-449a與c-Myc表達呈負相關性。隨后,我們構建了表達miR-449a的重組質粒GV214-miR-449a和表達c-Myc 3′-UTR及c-Myc 3′-UTR突變的重組質粒GV272-c-Myc 3′-UTR wt/mut。雙螢光素酶報告系統(tǒng)實驗證實,在LNCa P細胞中miR-449a直接通過與c-Myc 3′-UTR相結合靶向抑制c-Myc表達。利用GV214-miR-449a轉染前列腺癌LNCa P細胞,發(fā)現(xiàn)miR-449a增強IR誘導的細胞生長阻滯,提高LNCa P細胞對IR的敏感性。利用RNAi技術,敲低c-Myc表達同樣增強LNCa P細胞的IR敏感性。這些研究結果說明:miR-449a可以通過靶向下調c-Myc表達來增強前列腺癌細胞的輻射敏感性。但進一步的研究發(fā)現(xiàn):miR-449a增強腫瘤細胞電離輻射敏感性的功能并不是廣泛的。在Rb野生型的LNCa P和PC-3細胞中過表達miR-449a,降低電離輻射后的細胞活性,增強電離輻射誘導的細胞增殖抑制,最終使LNCa P和PC-3細胞對電離輻射敏感;但在Rb突變的DU-145細胞中過表達miR-449a,電離輻射后,細胞周期分布并無顯著性變化,細胞凋亡率增加也不明顯。通過分析前列腺癌細胞的分子生物學特征及采用WB分析發(fā)現(xiàn),LNCa P、PC-3和DU-145細胞有不同的p53和Rb蛋白表達狀態(tài)。一方面,LNCa P細胞表達野生型的p53、DU-145表達含有p53233leu和p53274phe兩種突變的p53,而PC-3細胞不表達任何p53蛋白,表現(xiàn)為p53缺失;另一方面,LNCa P和PC-3細胞表達野生型Rb蛋白,而DU-145細胞在Rb基因的21號外顯子缺失105bp的堿基對,表達無活性的截短體RB蛋白。因此,推測miR-449a增強前列腺癌細胞的輻射敏感性可能與RB蛋白的狀態(tài)相關。進一步采用WB分析檢測細胞周期和凋亡相關的信號蛋白表達發(fā)現(xiàn),miR-449a/c-Myc增強前列腺癌細胞的輻射敏感性與CDC25A/RB/E2F1信號通路相關。一方面,miR-449a/c-Myc可通過抑制CDC25A/RB/E2F1信號通路及Cyclin B1/Cdc2周期相關蛋白增強電離輻射誘導的G2/M期阻滯。另一方面,miR-449a/c-Myc也可通過下調凋亡靶基因Bcl-2的表達,激活線粒體凋亡信號通路相關的蛋白表達,誘導細胞凋亡。這些研究結果為探討前列腺癌的發(fā)生發(fā)展分子機理提供了新思路,考慮到miR-449a增強前列腺癌細胞輻射敏感性的潛能,本文的研究結果可為前列腺癌的放射治療提供一個新靶點。
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【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1640204