本文選題：腎癌　切入點(diǎn)：舒尼替尼　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景和目的近年來(lái),在世界范圍內(nèi)腎細(xì)胞癌(RCC)的發(fā)生率逐年上升。約20%的腎癌患者在疾病診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移,而且近30%的局限性腎癌患者在腫瘤切除后會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。隨著對(duì)腎癌發(fā)病機(jī)制的深入探索,受體酪氨酸激酶抑制劑被作為進(jìn)展性腎癌患者的一線治療方案。舒尼替尼(Sunitinib,Sutent?)是一種口服、多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶抑制劑,可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)、血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(KIT)等多種受體酪氨酸激酶的活性,因此,舒尼替尼具有抑制腫瘤血管和殺傷腫瘤細(xì)胞的雙重作用。但是約10-20%的進(jìn)展性腎癌患者在初次治療時(shí)就對(duì)舒尼替尼先天耐藥,而其余的患者往往在接受舒尼替尼治療6-15個(gè)月后出現(xiàn)耐藥和疾病進(jìn)展,這些現(xiàn)狀使得舒尼替尼并不能有效延長(zhǎng)腎癌患者的生存期。許多研究提出信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路的活化可能是腎癌舒尼替尼耐藥的潛在原因,然而其生物學(xué)機(jī)制尚待闡明。另一方面,目前尚缺乏預(yù)測(cè)舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)志物。因此,探索腎癌舒尼替尼耐藥的生物學(xué)機(jī)制以及尋找預(yù)測(cè)舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)志物十分迫切。近幾年,隨著二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,原本認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄 噪音‖的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lnc RNA)被證明具有重要的生物學(xué)作用。lnc RNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄本,其不編碼蛋白或者僅編碼很短的多肽。研究表明lnc RNA可在多水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),包括參與染色質(zhì)印記,與表觀修飾復(fù)合物或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,與mi RNA、m RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等。越來(lái)越多的證據(jù)表明lnc RNA參與調(diào)節(jié)腫瘤的多種生物學(xué)特性,包括增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、代謝等,然而lnc RNA在腫瘤耐藥尤其是舒尼替尼耐藥中的作用尚未見報(bào)道。因此,本課題的研究目的是探討lnc RNA在腎癌舒尼替尼耐藥中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制,為舒尼替尼抵抗的腎癌患者提供新的聯(lián)合治療靶點(diǎn),并且尋找可預(yù)測(cè)腎癌舒尼替尼治療反應(yīng)性的組織學(xué)和血清學(xué)標(biāo)志物,為腎癌的個(gè)性化治療提供重要參考。二、研究方法1.利用裸鼠皮下荷瘤模型和體內(nèi)連續(xù)傳代方法構(gòu)建舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞系。2.利用lnc RNA表達(dá)譜芯片篩選舒尼替尼耐藥的腎癌細(xì)胞系和親本細(xì)胞系中差異表達(dá)的lnc RNA。3.利用腎癌臨床樣本以及患者移植瘤樣本對(duì)lnc RNA表達(dá)水平進(jìn)行篩選。4.利用RNAi方法從上述lnc RNA中篩選出對(duì)耐藥細(xì)胞具有增敏作用的lnc RNA進(jìn)行后續(xù)研究。5.利用5‘RACE和3‘RACE技術(shù)克隆lnc ARSR轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng),并利用生物信息學(xué)(Phylo CSF、ORF-finder、CPAT)分析lnc ARSR的非編碼特性。6.根據(jù)5‘RACE結(jié)果,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)lnc ARSR的啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子FOXO,利用Ch IP-q PCR驗(yàn)證FOXO對(duì)lnc ARSR啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。7.利用Ambion公司的mir Vana?PARIS?試劑盒抽取腎癌患者血漿中的RNA,利用Realtime PCR和PCR產(chǎn)物測(cè)序確定血漿中l(wèi)nc ARSR的存在。8.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前及治療過(guò)程中的血樣,分析血漿中l(wèi)nc ARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反應(yīng)性和無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性,多因素分析評(píng)判l(wèi)nc ARSR作為患者預(yù)后判定的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性。9.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前的腫瘤組織樣本,通過(guò)RNA原位雜交檢測(cè)組織中l(wèi)nc ARSR表達(dá)水平,分析組織中l(wèi)nc ARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反應(yīng)性和無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性,多因素分析評(píng)判l(wèi)nc ARSR作為患者預(yù)后判定的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性。10.利用超高速離心的方法抽提細(xì)胞培養(yǎng)上清中的外泌體,檢測(cè)不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體中l(wèi)nc ARSR的表達(dá)量。11.利用RNA pull-down、RIP實(shí)驗(yàn),研究lnc ARSR進(jìn)入外泌體的機(jī)制。12.通過(guò)共培養(yǎng)、外泌體孵育、外泌體瘤內(nèi)注射等研究外泌體傳播舒尼替尼耐藥的作用。13.利用慢病毒介導(dǎo)的lnc ARSR過(guò)表達(dá)腎癌細(xì)胞系,研究lnc ARSR對(duì)腎癌敏感細(xì)胞的舒尼替尼反應(yīng)性的影響。14.利用慢病毒介導(dǎo)的sh RNA敲低腎癌耐藥細(xì)胞系中l(wèi)nc ARSR的表達(dá),研究lnc ARSR對(duì)耐藥細(xì)胞的舒尼替尼敏感性的影響。15.利用Western blot篩選表達(dá)受lnc ARSR調(diào)控的受體酪氨酸激酶,并在臨床樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證。16.利用Rescue方法,證明AXL與c-MET介導(dǎo)了lnc ARSR促進(jìn)舒尼替尼耐藥性的作用。17.利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lnc ARSR與AXL/c-MET共有的mi R-34/449結(jié)合序列,通過(guò)MS2-RIP實(shí)驗(yàn)、報(bào)告基因以及Western blot研究lnc ARSR對(duì)mi RNA-34/449的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合作用。18.利用裸鼠腎原位和皮下荷瘤模型,研究特異性靶向lnc ARSR的鎖核酸(LNA)或AXL/c-MET抑制劑對(duì)腎癌耐藥移植瘤的舒尼替尼反應(yīng)性的作用。三、研究結(jié)果1.腎癌舒尼替尼耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞的lnc RNA表達(dá)譜存在顯著差異。2.通過(guò)腎癌臨床樣本、患者移植瘤樣本及RNAi功能實(shí)驗(yàn)篩選出一條在腎癌耐藥細(xì)胞高表達(dá)且有功能的lnc RNA,命名為lnc ARSR(lnc RNA Activated in RCC with Sunitinib Resistance)。3.與治療前腎癌組織相比,舒尼替尼治療后耐藥復(fù)發(fā)的組織中l(wèi)nc ARSR表達(dá)升高。4.轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和FOXO3a通過(guò)招募組蛋白去乙�；敢种苐nc ARSR的轉(zhuǎn)錄。5.腎癌患者血漿中可檢測(cè)到lnc ARSR,且舒尼替尼耐藥患者的血漿中l(wèi)nc ARSR水平更高。6.接受舒尼替尼治療后腎癌患者血漿中l(wèi)nc ARSR高表達(dá)組患者的無(wú)進(jìn)展生存期低于lnc ARSR低表達(dá)組,且血漿lnc ARSR可作為患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。7.腫瘤組織中l(wèi)nc ARSR低表達(dá)組患者對(duì)舒尼替尼治療敏感,而lnc ARSR高表達(dá)組患者對(duì)舒尼替尼治療不敏感。并且在lnc ARSR低表達(dá)組,舒尼替尼治療與患者的更好預(yù)后具有相關(guān)性。8.hn RNPA2B1參與調(diào)控lnc ARSR進(jìn)入外泌體。9.耐藥細(xì)胞通過(guò)外泌體介導(dǎo)lnc ARSR在細(xì)胞間的傳遞,促進(jìn)舒尼替尼耐藥表型的播散。10.過(guò)表達(dá)lnc ARSR可提高腎癌敏感細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的耐藥性。11.敲低lnc ARSR表達(dá)可恢復(fù)腎癌耐藥細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的敏感性。12.lnc ARSR通過(guò)促進(jìn)AXL與c-MET的表達(dá)促進(jìn)腎癌細(xì)胞舒尼替尼耐藥。13.lnc ARSR作為ce RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi RNA-34/449家族,拮抗mi RNA-34/449對(duì)AXL和c-MET的抑制作用,促進(jìn)AXL和c-MET的表達(dá)。14.特異性靶向lnc ARSR的鎖核酸或AXL/c-MET抑制劑可以增加耐藥移植瘤對(duì)舒尼替尼的敏感性。四、結(jié)論本研究通過(guò)lnc RNA表達(dá)譜芯片、臨床樣本和功能實(shí)驗(yàn)篩選出一條在腎癌舒尼替尼耐藥細(xì)胞中高表達(dá)且有功能的新的lnc RNA,命名為lnc ARSR。lnc ARSR可通過(guò)外泌體從耐藥細(xì)胞傳遞至周圍細(xì)胞,促進(jìn)耐藥表型的播散。臨床研究表明腫瘤組織和血漿中l(wèi)nc ARSR高表達(dá)的腎癌患者對(duì)舒尼替尼治療反應(yīng)性差。機(jī)制研究表明,lnc ARSR作為ce RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi RNA-34和mi RNA-449家族,拮抗mi RNA-34/449對(duì)AXL和c-MET的抑制作用,促進(jìn)AXL和c-MET表達(dá)及下游STAT3、AKT、ERK信號(hào)通路的活化。體內(nèi)研究證明,靶向lnc ARSR或抑制AXL/c-MET能夠恢復(fù)耐藥移植瘤對(duì)舒尼替尼的敏感性。綜上所述,lnc ARSR不僅可以作為預(yù)測(cè)舒尼替尼治療反應(yīng)性的標(biāo)志物,而且可以作為腎癌舒尼替尼耐藥的治療靶點(diǎn),具有良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.11

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5 胡R，

本文編號(hào)：1607421