本文選題：融合蛋白　切入點(diǎn)：樹突狀細(xì)胞　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：如何靶向樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells, DCs)提高免疫治療效果是當(dāng)前惡性腫瘤治療性疫苗領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。5型腺病毒載體疫苗在體外的實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的感染效率,但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中腺病毒疫苗特異性感染DCs的效率欠佳。因此,如何提高腺病毒體內(nèi)特異性靶向DCs能力,增強(qiáng)DCs的感染效率,發(fā)揮腺病毒疫苗治療腫瘤作用,需要進(jìn)一步探討與研究。 研究目的：利用分子生物學(xué)方法,制備一種能夠?qū)ο俨《竞虳Cs進(jìn)行雙靶向的蛋白分子；使雙靶向融合蛋白一方面可以與腺病毒纖維頭節(jié)結(jié)合,另一方面可以與DCs表面分子DEC205結(jié)合,從而可以介導(dǎo)腺病毒疫苗靶向感染DCs,增強(qiáng)疫苗免疫效應(yīng)。 方法： 1.雙靶向融合蛋白的制備及活性鑒定：將5型腺病毒受體CAR的胞外段、噬菌體T4纖鏈蛋白以及抗小鼠DEC205單鏈抗體的基因序列拼接在一起,并進(jìn)行原核表達(dá)密碼子優(yōu)化；接著將優(yōu)化后的序列克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-CFmDEC,并將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白；然后采用GST瓊脂糖凝膠純化重組蛋白并利用PreScission Protease切割GST標(biāo)簽,獲得雙靶向融合蛋白(CFmDEC)。純化后的雙靶向融合蛋白經(jīng)Western blot鑒定其特異性,并用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等方法驗(yàn)證其生物學(xué)活性。 2.腎癌腺病毒疫苗的構(gòu)建及體外功能驗(yàn)證：將復(fù)合基因片段sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GMCSF-B7.1(tG250FcGB)克隆至穿梭載體pDC316中,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-tG250FcGB;利用AdMax腺病毒制備方法,將pDC316-tG250FcGB和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre在HEK293細(xì)胞內(nèi)重組,構(gòu)建可以表達(dá)G250融合抗原的腺病毒腎癌疫苗Ad5-tG250FcGB;然后,通過Western blot檢測分析Ad5-tG250FcGB在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。 3.CFmDEC協(xié)同Ad5-tG250FcGB抑瘤活性研究：最后,將腺病毒腎癌疫苗Ad5-tG250FcGB和CFmDEC在體外結(jié)合后免疫小鼠。觀察CFmDEC和Ad5-tG250FcGB聯(lián)合免疫方式對(duì)小鼠腎細(xì)胞癌的抑制作用；同時(shí)利用ELISA法檢測免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的改變；采用LDH法體外檢測免疫小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)；以及用Elispot法檢測免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性的IFN-γ的分泌。 結(jié)果： 1.成功制備了雙靶向融合蛋白：通過雙酶切及測序鑒定成功構(gòu)建了pGEX-CFmDEC原核表達(dá)質(zhì)粒,Western blot檢測證實(shí)了pGEX-CFmDEC在大腸桿菌BL21(DE3)中正確表達(dá)了雙靶向融合蛋白CFmDEC; ELISA分析證明雙靶向融合蛋白在體外可以與其相應(yīng)的受體分子有效結(jié)合；流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析證實(shí)CFmDEC可以在體外增強(qiáng)腺病毒對(duì)DCs的感染能力。 2.成功構(gòu)建腎癌腺病毒疫苗：通過雙酶切及測序鑒定成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pDC316-tG250FcGB；病毒基因組PCR及測序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了腎癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB; Ad5-tG250FcGB轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,通過Western blot檢測分析證實(shí)腺病毒疫苗中的目的抗原基因能夠有效表達(dá)。 3. CFmDEC增強(qiáng)Ad5-tG250FcGB的免疫效應(yīng)：Ad5-tG250FcGB和CFmDEC聯(lián)合免疫小鼠后,與對(duì)照組相比顯著抑制了腫瘤的生長,小鼠生存時(shí)間延長了7.2天；與單獨(dú)Ad5-tG250FcGB組比較,聯(lián)合疫苗組脾淋巴細(xì)胞分泌出更高水平的IFN-γ (412pg/mL)和IL-2(89.3pg/mL),聯(lián)合疫苗組的血清抗體IgG1/IgG2a比值與單獨(dú)疫苗組相比降低0.156,同時(shí)與單獨(dú)疫苗組相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率增加了13%。 結(jié)論：雙靶向融合蛋白CFmDEC可以在體外有效結(jié)合腺病毒載體,提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力,在小鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),抑制腎細(xì)胞癌的生長。本研究為腺病毒載體靶向DCs的免疫基因治療提供了有益的借鑒。
[Abstract]:Background: targeting dendritic cells (Dendritic Cells DCs) to improve the effect of immunotherapy is a research hotspot of.5 adenovirus vector vaccine in the treatment of malignant tumor of the field of vaccine showed good efficiency of infection experiments in vitro, but in vivo adenovirus virus vaccine efficiency specific infection DCs so poor. And how to improve the in vivo adenovirus targeting DCs ability, enhance the infection efficiency of DCs adenovirus vaccine for tumor therapy, play a role, need to be further discussed and studied.
Objective: using the method of molecular biology, a preparation of adenovirus and DCs dual targeting protein molecules; the dual targeting fusion protein can combine with adenovirus fiber scolex, on the other hand can be combined with DCs surface molecule DEC205, which can be mediated by adenovirus vaccine targeting DCs infection and enhance the immune effect of vaccine.
Method錛，

本文編號(hào)：1607305