本文選題：糖尿病腎病　切入點：腎小管上皮細胞　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥,嚴(yán)重危害人類的健康甚至生命。盡管腎小球損傷在糖尿病腎病早期就已出現(xiàn),但研究證實腎小管損傷在糖尿病腎功能受損過程中發(fā)揮著更重要作用。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化,上皮細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞導(dǎo)致細胞外基質(zhì)分泌及腎小管間質(zhì)纖維化是嚴(yán)重影響糖尿病患者腎臟功能的病理學(xué)改變。DKD的病因及發(fā)病機制復(fù)雜,涉及到多種因素,高糖作為影響糖尿病病人正常細胞代謝和功能的根本性因素,能夠?qū)е履I近端小管上皮細胞的功能和結(jié)構(gòu)改變及細胞外基質(zhì)沉積,引發(fā)腎小管間質(zhì)纖維化,在糖尿病腎損傷中發(fā)揮著重要作用。目前已知多條信號傳導(dǎo)途徑和糖尿病腎小管細胞外基質(zhì)沉積有關(guān),包括P38MAPK、ERK1/2和JAK/STAT等。近年來,PI3K/Akt通路被揭示與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化及細胞外基質(zhì)沉積增多相關(guān)�；罨腜I3K可催化膜表面PI(4,5)P2肌醇環(huán)上的3’羥基位磷酸化形成PI(3,4,5)P3。PI(3,4,5)P3作為第二信使與Akt及磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶PDK1的PH區(qū)結(jié)合,不僅導(dǎo)致Akt發(fā)生從細胞質(zhì)到細胞膜的轉(zhuǎn)位,還促使其構(gòu)象發(fā)生變化被活化引起上皮細胞轉(zhuǎn)分化及細胞外基質(zhì)沉積。含SH2結(jié)構(gòu)域的5’肌醇磷酸酶(SH2 domain-containing inositol5’-phosphatase,SHIP)可從PI(3,4,5)P3的5’位去除磷酸而將其轉(zhuǎn)變?yōu)镻I(3,4)P2,發(fā)揮對PI3K/Akt通路的負向調(diào)控作用。慢性髓性白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)細胞系K562細胞中SHIP基因缺失或位點突變后,通過影響5’磷酸酶活性導(dǎo)致PI3K/Akt途徑激活,降低依托泊苷化療藥物敏感性,使細胞增殖能力提高。新近有研究顯示,SHIP通過負向調(diào)控PI3K/Akt通路,在細胞外基質(zhì)分泌及纖維化的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。mi R-155敲除的小鼠中SHIP蛋白表達增加,抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,減輕博萊霉素在皮膚誘導(dǎo)的膠原合成及纖維化。SHIP基因敲除小鼠中,活化的Akt促進氣管上皮下膠原沉積,同時伴隨TGF-β1顯著增加。但糖尿病腎病中,SHIP是否通過調(diào)控PI3K/Akt通路參與了糖尿病腎小管上皮細胞外基質(zhì)沉積及纖維化的發(fā)生、發(fā)展及明確的機制還未見報道。本課題通過建立糖尿病小鼠模型和體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞HK2,系統(tǒng)探討了SHIP表達對腎小管上皮細胞外基質(zhì)沉積以及間質(zhì)纖維化的作用和調(diào)節(jié)機制,為糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化的延緩和防治提供新的研究思路,探索新的干預(yù)靶點。方法:1 SHIP蛋白在糖尿病小鼠腎組織中的表達雄性CD1小鼠隨機分為正常對照組(Control組)和糖尿病組(diabetic mellitus,DM組)。糖尿病模型小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,溶于0.1 M無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,p H 4.4,150 mg/kg),對照組小鼠只注射相當(dāng)體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,72 h后尾尖取血測定血糖,血糖≥16.7 m M者確定為糖尿病模型成功。DM小鼠成模后,每周監(jiān)測血糖,不符合標(biāo)準(zhǔn)者棄去,且于成模16周后留取24 h尿液和血清,處死DM組小鼠及對照組小鼠,切取腎臟。切取部分腎組織固定于4%多聚甲醛,用于HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)檢測;部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及RNA。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測腎皮質(zhì)SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Col 1和Col 3蛋白的表達,Real-time PCR檢測TGF-β1m RNA表達。2 SHIP表達對體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞外基質(zhì)分泌的影響人腎小管上皮細胞HK2在37°C,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)用含10%的胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。⑴檢測高糖對HK2細胞SHIP表達及細胞外基質(zhì)分泌的影響:將實驗細胞隨機分為5組,實驗前用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,使細胞同步化。高糖刺激細胞0、12、24、36、48 h后收集細胞,免疫熒光檢測SHIP表達,Western blot檢測SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin及α-SMA蛋白表達,ELISA方法檢測細胞外分泌Col 3蛋白。⑵檢測敲低SHIP基因?qū)φＬ桥囵B(yǎng)的HK2細胞外基質(zhì)分泌的直接影響:使用Lipofectamine?RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑將SHIP si RNA和陰性對照negative control si RNA分別轉(zhuǎn)染人腎小管上皮HK2細胞。細胞隨機分為正常對照組(normal control)、陰性對照組(negative control)、SHIP si RNA轉(zhuǎn)染組(SHIP si RNA)。轉(zhuǎn)染48 h后Western blot檢測SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、TGF-β1、E-cadherin及α-SMA蛋白表達,ELISA方法檢測細胞外分泌Col 3蛋白。⑶檢測過表達SHIP基因?qū)Ω咛钦T導(dǎo)的HK2細胞外基質(zhì)分泌的影響:使用Fu GENE?6轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒M90-SHIP和空白質(zhì)粒M90分別轉(zhuǎn)染入人腎小管上皮HK2細胞。細胞隨機分為正常糖組(5.5 m M glucose,normal glucose,NG)、高糖組(30 m M glucose,high glucose,HG)、高糖+空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(high glucose+control vector,HG+M90)、高糖+SHIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(high glucose+SHIP vector,HG+M90-SHIP)。轉(zhuǎn)染成功后高糖刺激48 h進行相關(guān)指標(biāo)的檢測,檢測方法及指標(biāo)同上。⑷檢測抑制PI3K/Akt通路對高糖誘導(dǎo)的HK2細胞外基質(zhì)分泌的影響:細胞隨機分為正常糖組(5.5 m M glucose,normal glucose,NG)、高糖組(30 m M glucose,high glucose,HG)、高糖+DMSO組(high glucose+DMSO,HG+DMSO)、高糖+30μM LY294002組(high glucose+LY294002,HG+LY294002)。⑸檢測抑制TGF-β1信號通路對敲低SHIP基因?qū)е碌腍K2細胞外基質(zhì)分泌的影響:細胞隨機分為正常糖組(normal glucose,NG)、正常糖+SHIP si RNA轉(zhuǎn)染組(NG+SHIP si RNA)、正常糖+SHIP si RNA轉(zhuǎn)染+3μM SB431542組(NG+SHIP si RNA+SB431542)。檢測方法及指標(biāo)同上。3腹腔注射重組腺病毒r Ad-INPP5D對糖尿病小鼠腎小管上皮細胞外基質(zhì)沉積的影響STZ腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病小鼠成模8周后,根據(jù)隨機分配原則將24只糖尿病小鼠分為:糖尿病組(DM group)、腺病毒對照組(DM+r Ad-EGFP group)和SHIP重組腺病毒組(DM+r Ad-INPP5D group);同周齡健康雄性CD1小鼠8只作為對照組(Control group)。腺病毒組小鼠于糖尿病成模8周后經(jīng)腹腔注射腺病毒載體5×108 PFU/只,每10天補注射一次,劑量同前,腺病毒注射8周后留取24 h尿液和血清,處死小鼠后切取腎臟。切取部分腎組織固定于4%多聚甲醛,用于HE染色、Masson染色及免疫組織化學(xué)檢測;部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及RNA。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測腎皮質(zhì)SHIP、phospho-Akt(Ser 473)、phospho-Akt(Thr 308)、Akt、TGF-β1、E-cadherin、α-SMA、Col 1及Col 3蛋白表達,Real-time PCR檢測TGF-β1 m RNA表達。結(jié)果:1 SHIP蛋白在糖尿病小鼠腎組織中的表達⑴與正常對照組小鼠相比,糖尿病組小鼠食量、尿量、血糖、肌酐、尿素氮、甘油三酯及腎重/體重均顯著升高(P0.05)。⑵HE、Masson染色可見糖尿病組小鼠腎小球體積增大,系膜基質(zhì)增多,間質(zhì)增寬細胞外基質(zhì)沉積增多。⑶免疫組化顯示SHIP、phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)主要在腎小管上皮細胞表達。正常對照組SHIP在腎小管上皮細胞胞漿中大量表達,而糖尿病小鼠組SHIP在腎小管上皮細胞胞漿中僅見少量表達,與對照組相比降低86.7%;phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)在對照組腎小管有少量表達,在糖尿病組表達明顯增加,與對照組相比分別增加2.99倍和2.64倍。Western blot檢測顯示,與對照組比較,糖尿病組小鼠腎組織中SHIP蛋白表達下降73.19%,phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)蛋白表達分別升高3.40倍和3.22倍。⑷免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示糖尿病組小鼠腎組織中TGF-β1在腎小管上皮細胞胞漿中大量表達,E-cadherin在腎小管細胞漿及細胞膜表達明顯減少,α-SMA除在血管平滑肌細胞表達之外,且在腎小管上皮細胞胞漿及間質(zhì)中大量表達,Col 1和Col 3大量表達于腎小管上皮細胞胞漿及腎間質(zhì)中,與對照組比較均有顯著性差異(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果同樣顯示,糖尿病組小鼠腎皮質(zhì)組織TGF-β1、α-SMA及Col 3蛋白表達與正常對照組相比分別增高1.99倍、2.48倍和4.51倍,E-cadherin表達降低67.38%。Real-time PCR結(jié)果顯示,糖尿病組小鼠腎皮質(zhì)組織TGF-β1m RNA表達明顯高于對照組小鼠(P0.05)。2 SHIP表達對體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞外基質(zhì)分泌的影響⑴與高糖0 h相比,SHIP蛋白在高糖刺激24 h開始降低,且隨高糖刺激時間延長呈降低趨勢,高糖刺激48 h SHIP表達量較高糖刺激0 h表達量較低62.2%。高糖刺激下Akt磷酸化水平升高,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表達呈時間依賴性,48 h后表達量分別是高糖刺激0 h表達量的2.19倍和3.50倍。高糖刺激下細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化且細胞外基質(zhì)分泌增多,TGF-β1、α-SMA及分泌的Col 3表達量于48 h時分別是高糖刺激0 h表達量的2.08倍、4.96倍及1.41倍,E-cadherin表達量減少61.6%。⑵SHIP si RNA轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的HK2細胞明顯降低SHIP蛋白的表達(P0.05)。SHIP si RNA轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)的HK2細胞Akt磷酸化水平明顯升高,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表達量分別是陰性對照組表達量的4.76倍和3.89倍,細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化且細胞外基質(zhì)分泌增多,TGF-β1、α-SMA及分泌的Col 3表達增高,E-cadherin表達減少(P0.05)。⑶M90-SHIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達SHIP蛋白能夠顯著抑制高糖誘導(dǎo)的Akt活化,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)的表達量較M90空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表達量分別降低42.2%和38.3%。過表達SHIP基因減少高糖誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)分泌,M90-SHIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與M90空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比TGF-β1、α-SMA及Col 3表達量分別降低48.9%、59.4%和43.7%,E-cadherin表達量增加2.11倍。⑷LY294002能顯著抑制高糖誘導(dǎo)的Akt磷酸化,phospho-Akt(Ser 473)和phospho-Akt(Thr 308)表達量分別降低73.4%和54.3%。阻斷PI3K/Akt信號通路可減輕高糖導(dǎo)致的細胞轉(zhuǎn)分化,LY294002組TGF-β1和α-SMA蛋白分別降低65.9%和65.7%,而E-cadherin蛋白增加1.87倍。LY294002同時可逆轉(zhuǎn)高糖導(dǎo)致的SHIP蛋白低表達(P0.05)。⑸與SHIP si RNA轉(zhuǎn)染組相比,TGF-β1信號通路阻斷劑SB431542顯著降低HK2細胞α-SMA及分泌的Col 3表達量,表達量分別降低37.4%和51.2%,而E-cadherin蛋白增加1.99倍。3腹腔注射SHIP重組腺病毒(r Ad-INPP5D)對糖尿病小鼠腎小管上皮細胞外基質(zhì)沉積的影響⑴糖尿病組與腺病毒對照(r Ad-EGFP)組的小鼠食量、尿量、血糖、肌酐、尿素氮、甘油三酯及腎重/體重均顯著高于對照組,腹腔注射SHIP重組腺病毒(r Ad-INPP5D)可顯著改善糖尿病小鼠的肌酐、尿素氮、甘油三酯(P0.05),但小鼠食量、尿量、血糖及腎重/體重均無顯著差異(P0.05)。⑵Masson染色觀察,糖尿病組和r Ad-EGFP組的小鼠與對照組相比間質(zhì)增寬細胞外基質(zhì)沉積增多,單核及淋巴細胞浸潤明顯,r Ad-INPP5D組糖尿病小鼠的上述病理改變明顯減輕。⑶免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:糖尿病組和r Ad-EGFP組與對照組相比SHIP蛋白表達減少,僅見腎小管上皮細胞胞漿中少量表達,而r Ad-INPP5D組SHIP蛋白表達明顯增多,表達量是r Ad-EGFP組的2.91倍;糖尿病組和r Ad-EGFP組phospho-Akt(Ser473,Thr 308)在腎小管上皮細胞胞漿中表達顯著增多,而r Ad-INPP5D組逆轉(zhuǎn)了糖尿病導(dǎo)致的phospho-Akt(Ser 473,Thr 308)蛋白表達增加(P0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示:糖尿病組和r Ad-EGFP組與對照組相比SHIP蛋白表達減少,而r Ad-INPP5D組小鼠腎皮質(zhì)組織中SHIP蛋白表達與r Ad-EGFP組相比增加3.36倍;糖尿病導(dǎo)致的phospho-Akt(Ser473,Thr 308)表達升高,在r Ad-INPP5D組小鼠腎皮質(zhì)組織中分別被下調(diào)65.26%和70.38%;總Akt在各組小鼠腎皮質(zhì)組織中的表達沒有明顯差異(P0.05)。⑷免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,糖尿病組和r Ad-EGFP組TGF-β1在腎小管上皮細胞胞漿中大量表達,E-cadherin在腎小管細胞漿及細胞膜表達明顯減少,Col 1和Col 3大量表達于腎小管上皮細胞胞漿及腎間質(zhì)中,而r Ad-INPP5D組過表達SHIP降低糖尿病導(dǎo)致的腎小管上皮細胞胞漿中TGF-β1表達,減少腎小管上皮細胞胞漿及腎間質(zhì)中Col 1和Col 3表達,并逆轉(zhuǎn)糖尿病誘導(dǎo)的E-cadherin蛋白低表達(P0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,糖尿病組和r Ad-EGFP組TGF-β1、α-SMA及Col 1蛋白顯著增加,E-cadherin蛋白表達降低,腹腔注射腺病毒r Ad-INPP5D可導(dǎo)致糖尿病誘導(dǎo)的TGF-β1、α-SMA及Col 1表達分別降低47.66%、44.52%和59.13%,E-cadherin蛋白增加2.48倍。Real-time PCR結(jié)果顯示,r Ad-INPP5D組可逆轉(zhuǎn)糖尿病導(dǎo)致的TGF-β1m RNA表達增加(P0.05)。結(jié)論:1在糖尿病小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的HK2細胞中SHIP表達降低,且伴隨PI3K/Akt信號通路激活,細胞外基質(zhì)沉積增多。提示SHIP/PI3K/Akt信號通路可能參與糖尿病腎病腎小管上皮細胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致的細胞損傷。2應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)抑制正常糖培養(yǎng)下HK2細胞SHIP的表達,能促進PI3K/Akt信號通路激活,且顯著增加腎小管上皮細胞外基質(zhì)分泌,提示SHIP對腎小管上皮細胞有保護作用,高糖刺激導(dǎo)致的腎小管上皮細胞外基質(zhì)分泌可能是通過降低SHIP表達實現(xiàn)的。3 SHIP基因過表達及LY294002通過抑制PI3K/Akt信號通路活化,減輕了糖尿病小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)的HK2細胞細胞外基質(zhì)分泌,提示SHIP可通過抑制PI3K/Akt信號通路來產(chǎn)生對糖尿病腎病的治療效果。4 SB431542阻斷敲低SHIP導(dǎo)致的HK2細胞外基質(zhì)分泌,提示HK2細胞SHIP表達下降所導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)分泌是通過TGF-β1通路實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1571292