本文選題：膀胱癌　切入點(diǎn)：微小RNA　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：膀胱癌是泌尿道最常見(jiàn)的惡性腫瘤,直接威脅著眾多患者的生存健康和質(zhì)量。在全世界范圍內(nèi),它是男性中第七常見(jiàn)的腫瘤,而在女性中則排在第十七位。膀胱癌是一種進(jìn)展性的移行上皮來(lái)源腫瘤。有大約三分之一的膀胱癌會(huì)發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然膀胱癌的診治一直在不斷發(fā)展和進(jìn)步,但是根治性膀胱切除術(shù)仍然是浸潤(rùn)性膀胱癌的治療金標(biāo)準(zhǔn),文獻(xiàn)報(bào)道5年生存率只有62%。如何抑制膀胱癌的進(jìn)展已經(jīng)成為目前治療研究上的關(guān)鍵問(wèn)題,而尋找新的分子靶點(diǎn)、探究膀胱癌進(jìn)展的分子機(jī)制則是研究熱點(diǎn)。MicroRNA (miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)發(fā)約為19-22nt,具有在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)功能的內(nèi)源性非編碼小RNA。它們可以直接靶向目的基因信使RNA(messenger RNA, mRNA)的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)上的特定序列來(lái)抑制或是降解靶基因mRNA,從而下調(diào)靶基因的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA表達(dá)異常與膀胱癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。目的：在收集的膀胱癌組織標(biāo)本以及膀胱癌細(xì)胞株中利用熒光定量PCR法檢測(cè)miR-433的表達(dá)情況,探索miR-433表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。采用獲得性功能實(shí)驗(yàn)觀察miR-433在膀胱癌細(xì)胞系T24和UM-UC-3中的生物學(xué)功能。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)尋找miR-433的直接作用靶點(diǎn),并通過(guò)分析靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能,驗(yàn)證miR-433對(duì)于靶點(diǎn)的調(diào)控價(jià)值,以及下游介導(dǎo)的分子信號(hào)通路。方法：1)在13對(duì)配對(duì)的膀胱癌組織標(biāo)本中檢測(cè)miR-433的相對(duì)表達(dá)量,統(tǒng)計(jì)分析miR-433在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)差異,并分析miR-433表達(dá)下調(diào)是否和啟動(dòng)子區(qū)高甲基化有關(guān)；2)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-433模擬體(mimic)上調(diào)miR-433表達(dá)量來(lái)進(jìn)行獲得性功能實(shí)驗(yàn)。通過(guò)CCK-8、平板克隆形成、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)探索上調(diào)miR-433的表達(dá)對(duì)于細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力的影響；3)在線生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)miR-433的直接靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè),然后利用熒光定量PCR和Western Blot等證實(shí)靶基因mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化,并利用熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-433的靶向序列進(jìn)行鑒定,并進(jìn)一步使用RNA干擾等實(shí)驗(yàn)來(lái)明確靶向調(diào)控關(guān)系和下游機(jī)制。結(jié)果：1)miR-433在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)。我們使用熒光定量PCR在13對(duì)臨床膀胱癌組織標(biāo)本和癌旁組織,以及三株膀胱癌細(xì)胞系T24, UM-UC-3和5637中檢測(cè)了miR-433的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-433在腫瘤組織中的表達(dá)量相比癌旁組織顯著降低。miR-433在三株膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)量相比SV-HUC-1也顯著降低。2)BSP結(jié)果顯示在膀胱癌細(xì)胞株(T24, UM-UC-3和5637)中,miR-433啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化水平狀態(tài)。5-氮雜-2'-脫氧胞苷治療(5-氮雜胞苷)處理后miR-433的表達(dá)水平顯著上升。3)獲得性功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示過(guò)表達(dá)miR-433可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和平板克隆形成。此外,上調(diào)miR-433的表達(dá)還能抑制細(xì)胞的遷移侵襲能力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),其主要是通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)來(lái)介導(dǎo)。4)我們利用兩種方法來(lái)篩查miR-433潛在的直接靶基因：首先是生物信息學(xué)預(yù)測(cè),然后是熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)加以證實(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CREB1和c-Met是miR-433的直接靶標(biāo)。5)我們使用siRNA下調(diào)CREB1或是c-Met的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移侵襲能力和EMT進(jìn)程受到抑制,其主要也是通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/GSK-3β/Snail通路所介導(dǎo)的,這和miR-433在膀胱癌中的功能相一致。此外,CREB1表達(dá)量是膀胱癌患者總生存時(shí)間的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。6) miR-409-3p參與了miR-433對(duì)于細(xì)胞遷移侵襲能力的抑制。c-Met可以調(diào)節(jié)miR-409-3p和miR-433的表達(dá)量。而反過(guò)來(lái)miR-409-3p和miR-433又可以直接靶向c-Met基因。miR-433/miR-409-3p和c-Met之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)。miR-433可以通過(guò)靶向c-Met間接調(diào)控miR-409-3p的表達(dá)量。結(jié)論：1)膀胱癌組織中miR-433的表達(dá)量顯著下調(diào),其和啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化有關(guān)。2)過(guò)表達(dá)miR-433可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、平板克隆形成、遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí),miR-433可以調(diào)控AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)通路。3) CREB1和c-Met是miR-433的直接作用靶點(diǎn),它們也可以通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/GSK-3β/Snail信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展。4)由于miR-433/miR-409-3p和c-Met之間存在負(fù)反饋調(diào)控,miR-433可以通過(guò)靶向c-Met間接調(diào)控miR-409-3p的表達(dá)量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R737.14

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