本文選題：金納米粒　切入點：阿霉素腎病　出處：《東南大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：金納米粒(gold nanoparticles, GNPs)由于制備簡單、理化性質(zhì)穩(wěn)定、光學(xué)性質(zhì)可控以及無顯著毒性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。但是近年研究發(fā)現(xiàn)金納米粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用仍然存在著許多不確定的因素,且對機(jī)體主要排泄器官.腎臟的相關(guān)研究較少,特別是疾病狀態(tài)下的毒理作用尚未見報道。顯然,開展相關(guān)研究對于加快GNPs臨床應(yīng)用具有重要意義。慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)是一組具有高患病率、高死亡率的嚴(yán)重威脅人類生命健康的慢性進(jìn)展性疾病。腎小管損傷以及間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病腎功能減退的關(guān)鍵因素。值得注意的是：藥物及毒物性腎損傷多累及腎小管上皮細(xì)胞；缺氧是細(xì)胞最常見的病理狀態(tài),腎臟病變時,腎小管上皮細(xì)胞常存在缺氧。基于此,我們提出本研究假說：腎臟病時腎小球濾過膜損傷,GNPs進(jìn)入尿液增加,繼之被腎小管上皮細(xì)胞重吸收,從而對后者造成損傷；若伴有缺氧,GNPs將加重腎小管上皮細(xì)胞損傷,并促進(jìn)小管間質(zhì)纖維化。為了驗證上述假說,本研究應(yīng)用阿霉素腎病小鼠模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,借助多種手段,觀察GNPs對腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用,并探討相關(guān)機(jī)制。方法：1.用化學(xué)還原法制備粒徑分別為5nm和13nm的GNPs,并用TEM、DLS和UV—vis光譜等表征手段對其進(jìn)行表征。2.通過單次鼠尾靜脈注射阿霉素構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型,以正常的BALB/C小鼠作為對照,將5nm和13nm的GNPs通過尾靜脈注射至小鼠體內(nèi),采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)、病理組織切片、透射電鏡切片、TUNEL凋亡染色等方法研究納米粒在小鼠體內(nèi)的吸收、分布,并觀察其對阿霉素腎病小鼠腎臟的損傷情況。3.GNPs處理缺氧培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞,觀察腎小管上皮細(xì)胞攝取金納米粒、細(xì)胞的增殖活性變化,并檢測細(xì)胞自噬、凋亡和氧化應(yīng)激水平。4.用GNPs處理缺氧培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞,收集培養(yǎng)上清,繼之用培養(yǎng)上清處理腎小管上皮細(xì)胞,觀察GNPs對缺氧的巨噬細(xì)胞NLRP3炎性小體激活以及產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)對腎小管上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的影響。結(jié)果：1.成功合成了符合要求的粒徑5nm和13nm、大小均勻、分散性良好、性質(zhì)穩(wěn)定的金納米顆粒,滿足了后續(xù)實驗要求。2.通過單次鼠尾靜脈注射10mg/kg阿霉素成功建立了阿霉素腎病小鼠模型。ICP-MS檢測結(jié)果顯示,5nm GNPs經(jīng)靜脈注射至阿霉素腎病小鼠后在其腎臟內(nèi)的聚集增加。組織學(xué)和透射電鏡研究發(fā)現(xiàn),實驗組腎臟易見腎小管上皮細(xì)胞水腫(顆粒變性和空泡變性)以及蛋白管型。TUNEL染色證實5nm GNPs增加阿霉素腎病小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡。3.光鏡及透射電鏡檢查均發(fā)現(xiàn),GNPs更易聚集于缺氧細(xì)胞內(nèi),并伴有自噬體和空泡形成增加。CCK-8和LDH檢查結(jié)果顯示,5nm GNPs在缺氧HK-2細(xì)胞內(nèi)的聚集能夠造成細(xì)胞生存力降低,加重細(xì)胞膜的破壞,促進(jìn)細(xì)胞中LDH的漏出。Annexin V-FITC/PI雙染檢測顯示,5nm的(GNPs(50 nM)可以有效地誘導(dǎo)缺氧HK-2細(xì)胞凋亡。TEM和免疫熒光的結(jié)果提示,5nm的GNPs(50 nM)可促進(jìn)細(xì)胞自噬,且該作用在缺氧情況下明顯增強(qiáng)。自噬抑制劑(3.MA)處理后發(fā)現(xiàn),在常氧條件下,自噬可抑制GNPs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但在缺氧時自噬可促進(jìn)GNPs引起的細(xì)胞凋亡。GNPs處理后,缺氧細(xì)胞ROS水平明顯增加,線粒體膜電位顯著下降。4. GNPs在缺氧的巨噬細(xì)胞內(nèi)的聚集也較常氧情況下明顯增加,聚集的GNPs能降低缺氧細(xì)胞的增殖能力,破壞缺氧細(xì)胞的細(xì)胞膜。qRT-PCR和Western Blot的結(jié)果提示,50nM GNPs在缺氧情況下可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體的活化,進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-1和IL-1β的釋放增加,且ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine, NAC)能顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的缺氧細(xì)胞NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表達(dá),說明ROS在GNPs促進(jìn)缺氧細(xì)胞NLRP3炎性體活化中起了重要作用。Western Blot和免疫熒光的結(jié)果顯示,5nm的GNPs (50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-18的分泌可以顯著提高缺氧HK-2細(xì)胞間皮特異性標(biāo)記α-SMA表達(dá)率,而降低上皮特異性標(biāo)志物E-cad的表達(dá)。z-VAD-fmk可顯著抑制GNPs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Caspase-1和IL-1β產(chǎn)生,同時該抑制劑還可使HK-2細(xì)胞a-SMA的表達(dá)顯著降低,而E-cadherin的表達(dá)增加。這些結(jié)果共同提示5nm的GNPs(50nM)誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌可以促進(jìn)缺氧腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。結(jié)論：1.阿霉素腎病小鼠腎臟內(nèi)5nm GNPs聚集增多,提示腎臟疾病狀態(tài)下GNPs更易蓄積于腎臟,從而加劇腎臟損傷,且這一作用可能是通過促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞水腫和凋亡而實現(xiàn)。2.常氧情況下,GNPs進(jìn)入細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,使受損蛋白、細(xì)胞器等降解以維持細(xì)胞生存；而在缺氧情況下,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的納米粒增加,誘導(dǎo)過度自噬,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。ROS的明顯增加和線粒體膜電位的顯著下降可能是GNPs促進(jìn)缺氧細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。3.缺氧情況下,GNPs在巨噬細(xì)胞內(nèi)亦聚集增加,可引起細(xì)胞增殖活性下降并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性體的活化,進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)：而GNPs誘導(dǎo)的缺氧巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌可以促進(jìn)缺氧腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R692

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