本文關(guān)鍵詞： 纖維蛋白原 局灶節(jié)段腎小球硬化 炎癥 足細胞 Toll樣受體4 慢性腎臟病 纖維蛋白原 預測 進展　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的已有研究報道TLR4表達在免疫細胞、炎癥細胞和足細胞。Fibrinogen可以通過Toll-like receptor 4(TLR4)參與血管壁疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的炎癥。Fibrinogen激活巨噬細胞分泌白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子、單核細胞趨化蛋白1。足細胞損傷是形成蛋白尿的一個重要原因,可導致腎小球硬化癥。有報道體外實驗中fibrinogen通過TLR4刺激足細胞分泌趨化因子和細胞因子。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)尿液fibrinogen水平在局灶節(jié)段腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者中是顯著升高的。Fibrinogen是否可以通過TLR4信號通路導致足細胞破壞尚未可知。因此,本研究的目的:(1)探索fibrinogen是否導致足細胞細胞骨架破壞和凋亡增加?(2)Fibrinogen是否通過TLR4-p38MAPK-NFκB P65信號通路介導上述效應?(3)Fibrinogen是否參與FSGS中足細胞的損傷?材料與方法(1)在體外培養(yǎng)的人足細胞中加入fibrinogen(分別為20μg/ml,200μg/ml,80μg/ml三個劑量),對照組加入等量PBS;分別孵育12h和24h。利用流式細胞術(shù)檢測凋亡率情況和免疫熒光檢測細胞骨架F-actin。在體外siRNA轉(zhuǎn)染實驗中,先分別利用controlsiRNA、TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染足細胞12h,再加入fibrinogen(800μg/ml)孵育24h。然后通過qRT-PCR檢測TLR4mRNA水平,觀察阻斷效果。利用流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡率,免疫熒光檢測F-actin。同時Western Blot檢測足細胞TLR4、總NFκB p65、磷酸化NFκB p65、總p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的水平。(2)在阿霉素小鼠FSGS模型中,分別于第1周、2周、4周、6周收集尿和腎臟。檢測尿 ACR(the ratio of albumin to creatinine);利用 ELISA 法檢測尿上清液fibrinogen的水平。對尿液fibrinogen與尿ACR、足突融合進行相關(guān)性分析。對小鼠腎臟進行病理檢查(PAS染色、光鏡、電鏡);免疫熒光雙重染色分別檢測podocin與TLR4,fibrinogen與TLR4的共定位表達水平。統(tǒng)計學方法所有的細胞實驗重復三次以上。連續(xù)變量數(shù)值以均數(shù)±標準差(SD)或中位數(shù)(四分位間距,第25和第75百分位數(shù))表示。GraphPad Prism 5軟件(La Jolla,CA)進行統(tǒng)計分析,雙側(cè)t檢驗、非參數(shù)檢驗用來分析任意兩組間的差異。變量之間的相關(guān)性使用Spearman's相關(guān)分析方法進行。P0.05認為有統(tǒng)計學差異,P0.01認為差異更顯著。結(jié)果(1)200μg/ml,800μg/ml fibrinogen干預可引起足細胞細胞骨架F-actin的明顯破壞和凋亡率顯著增高,與未處理組比較該差異有統(tǒng)計學意義。(2)在轉(zhuǎn)染實驗中,與 control siRNA+fibrinogen 組比較,TLR4 siRNA+fibrinogen(800μg/ml)組中足細胞的凋亡率顯著降低,F-actin的破壞亦明顯減輕。TLR4 mRNA表達下調(diào)和蛋白表達減少;磷酸化NF κB p65和磷酸化p38 MAPK的水平降低,Fibrinogen介導的TLR4信號通路下游分子NF κB p65和p38 MAPK的活化被抑制。(3)阿霉素小鼠FSGS模型的尿液ACR和fibrinogen水平顯著高于生理鹽水處理小鼠組,并且尿液fibrinogen和ACR成正相關(guān)(r=0.65,P0.001)。6周時阿霉素處理組小鼠的腎臟PAS染色可見FSGS樣病理改變,電鏡示足突融合程度較生理鹽水處理組嚴重(P0.001)。免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示:阿霉素處理組小鼠腎臟podocin的表達較生理鹽水組顯著減低(P=0.0001);而fibrinogen與TLR4共定位表達且增高,與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.0001)。結(jié)論Fibrinogen可以通過活化TLR4-p38 MAPK-NFκB p65信號通路介導足細胞的細胞骨架破壞和凋亡;可能藉此參與FSGS足細胞的損傷。背景與目的慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)是一個全球健康問題和進展性疾病,有較高的心血管疾病、終末期腎臟病等并發(fā)癥風險。我們之前發(fā)現(xiàn)fibrinogen通過TLR4介導足細胞細胞骨架破壞和細胞凋亡;FSGS患者尿液fibrinogen水平是顯著增高的。另有研究報道fibrinogen參與腎纖維化。然而,尿液fibrinogen能否反映FSGS患者病情的活動與緩解尚待探索;尿液fibrinogen與CKD患者腎臟遠期預后的相關(guān)性研究資料亦有限�；谥暗馁Y料,本研究的目的:(1)探索尿液fibrinogen水平的變化和FSGS疾病活動之間的關(guān)系;(2)探索尿液fibrinogen對CKD患者長期腎生存的影響。對象與方法1.為了研究尿液fibrinogen水平和FSGS病情活動的關(guān)系,從南京總醫(yī)院國家腎臟病臨床研究中心入組50例FSGS和50例健康對照。利用ELISA法檢測尿液fibrinogen水平。在FSGS患者中對足突融合程度進行定量分析。并將尿液fibrinogen分別與24h蛋白尿、足突寬度進行相關(guān)性分析。同時分析了服用強的松治療前后尿液fibrinogen水平的變化與FSGS病情活動度的關(guān)系。2.為了探索尿液fibrinogen對CKD患者長期腎生存的影響,從南京總醫(yī)院國家腎臟病臨床研究中心入組402例CKD1-4期患者,包括101例糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN),94 例特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN),55 例特發(fā)性 FSGS(idiopathic focal segmental glomerulonephritis,FSGS)和 152 例 IgA 腎病患者(IgA nephropathy,IgAN)。納入標準:蛋白尿0.3 g/24 h;病理類型均經(jīng)腎活檢證實;eGFR≥15ml/min/per1.73m2;18-65歲。排除標準:繼發(fā)性因素;病毒感染;腎臟病家族史。中位隨訪時間35個月(IQR:24.33-78.00月)。收集患者年齡、性別、血壓、24h尿蛋白和血清白蛋白數(shù)據(jù)。尿液fibrinogen由ELISA方法檢測,并用尿肌酐進行校正。eGFR由CKD-EPI公式計算。腎臟終點(ESRD)定義為eGFR15 ml/min/per 1.73 m2或接受腎臟替代治療持續(xù)3月以上。腎小管萎縮間質(zhì)纖維化(Interstitial Fibrosis and Tubular Atrophy,IFTA)評分:0,無;1,25%;2,25-50%;3,50%總面積。腎小球節(jié)段硬化:50%;球性硬化:腎小球的50%以上硬化。統(tǒng)計學方法利用SPSS19.0(Chicago,IL)進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距,第25和第75百分位數(shù))表示;分類變量則以百分比表示。雙側(cè)Mann-Whitney檢驗或Kruskal Wallis檢驗用于比較組間差異。配對t檢驗用來分析強的松治療前后尿液fibrinogen水平的變化。Spearman's相關(guān)分析法用以進行變量間的相關(guān)性檢驗。尿液fibrinogen/cr原始數(shù)值進行l(wèi)ogi0轉(zhuǎn)換后再進行Logistic回歸和Cox回歸分析。雙分類Logistic回歸用于分析影響腎臟終點的危險因素。Kaplan-Meier方法進行腎臟的生存分析。利用ROC曲線下面積的比較來判斷不同模型預測腎臟生存的優(yōu)劣,并利用似然比檢驗、AIC(Akaike information criterion),IDI(Itegrated Discrimination Improvement)、NRI(Net Reclassification Improvement)對不同的模型進行比較。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果尿液fibrinogen水平與FSGS疾病活動相關(guān)FSGS患者尿液fibrinogen水平是顯著高于正常人(P0.001)。FSGS患者尿液fibrinogen分別與24h蛋白尿成正相關(guān)(r=0.55,P0.0001),與足突寬度成正相關(guān)(r=0.73,P0.0001)。強的松治療后,完全緩解組(n=29例)與治療前比較尿液fibrinogen水平顯著降低(P0.0001);而未緩解組(n=21例)尿液fibrinogen水平在治療前后無明顯差別(P=0.48)。尿液fibrinogen是影響CKD患者腎臟生存的獨立危險因素按尿液fibrinogen水平將CKD患者分為三組:tertile1(低水平組),tertile2(中等水平組),和tertile3(高水平組)。CKD患者尿液fibrinogen水平顯著高于正常對照組(P0.0001)。在CKD1-4期(包括FSGS,IMN,IgAN和DN)患者,尿液fibrinogen分別與蛋白尿正相關(guān)(r=0.644;P0.0001),與IFTA正相關(guān)(r=0.104;P=0.037);而尿液fibrinogen與eGFR負相關(guān)(r=-0.198;P0.0001)。尿液fibrinogen與腎小球球性硬化和階段硬化之間無相關(guān)性。在隨訪期間16.9%(68/402)發(fā)生ESRD。Kaplan-Meier分析表明基線尿液fibrinogen水平越高,發(fā)生ESRD的風險越大。CKD患者的長期腎生存率:tertile 3tertile 2tertile 1。經(jīng)單變量和多變量logistic和Cox回歸分析證實,基線尿液fibrinogen是CKD進展至ESRD的獨立危險因素,在校正年齡、性別、高血壓、蛋白尿、疾病類型、eGFR和IFTA后基線尿液fibrinogen仍具有統(tǒng)計學意義。增加尿液fibrinogen可以改善模型預測CKD患者發(fā)生ESRD的準確度。相對于由eGFR、蛋白尿和高血壓組成的模型基礎上,加入尿液fibrinogen的模型(由尿液fibrinogen、eGFR、蛋白尿和高血壓組成)可以使得AUC從0.73增加到0.76(經(jīng)似然比檢驗有統(tǒng)計學差異,P=0.0033),AIC從333.64降到326.99。另外,我們分層分析了模型在DN和non-DN患者中的預測價值,發(fā)現(xiàn)加入尿液fibrinogen的模型在DN患者中預測新發(fā)ESRD更好。結(jié)論1.尿液fibrinogen可以反映FSGS病情活動及對強的松的治療反應。2.尿液fibrinogen作為一項非侵入性的指標是預測CKD1-4期(包括FSGS,IMN,IgAN和DN)患者進展至ESRD的獨立危險因素。
[Abstract]:BACKGROUND & AIM : It has been reported that the expression of Toll - like receptor 4 ( TLR ) in immune cells , inflammatory cells and foot cells has been reported . (2)鍦ㄩ樋闇夌礌灝忛紶FSGS妯″瀷涓，

本文編號：1528254