本文關(guān)鍵詞： SIRT3 高血壓 腎臟 足細胞 SIRT3 KLF15 和厚樸酚 高血壓腎臟損害 足細胞　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:高血壓是慢性腎臟病的主要原因之一。高血壓腎損害,主要表現(xiàn)為蛋白尿、進展的腎臟纖維化和炎癥,是高血壓的主要并發(fā)癥之一。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是高血壓腎臟損害的一個主要調(diào)節(jié)因素,并且在慢性腎臟病的發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。蛋白尿是高血壓腎臟損害的一個獨立危險因素,并且可以加重腎臟纖維化。大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的產(chǎn)生和累積導(dǎo)致了腎臟纖維化,從而造成了腎臟實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和腎臟功能的損害。腎臟纖維化的程度與高血壓腎臟病的預(yù)后息息相關(guān)。足細胞,是一種終末分化的腎小球臟層上皮細胞,位于腎小球濾過膜的最外層。足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成部分,其結(jié)構(gòu)也是比較復(fù)雜的。由胞體以及向外伸展并相互交錯的足突組成,在阻止蛋白尿的產(chǎn)生及維持腎小球濾過屏障完整性上發(fā)揮了重要的作用。除此之外,足細胞的損傷可以引起促纖維化因子的累積,從而導(dǎo)致腎臟纖維化和慢性腎臟病。纖連蛋白及Ⅳ型膠原是重要的纖維化因子,它們的減少可直接抑制甚至扭轉(zhuǎn)高血壓引起的腎臟損害。SIRT3是NAD+依賴的去乙�；讣易宄蓡T之一,位于細胞內(nèi)的線粒體基質(zhì),作為一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子參與了許多生物過程。SIRT3可以在翻譯后修飾過程中,通過調(diào)節(jié)底物的去乙�；癄顟B(tài)而參與許多慢性疾病。近年來研究表明,SIRT3可以直接去乙�；疓SK3β,從而抑制TGFβ1信號通路,改善與老化相關(guān)的組織纖維化。在腎臟中,已有報道表明,順鉑引起的急性腎臟損傷模型中,SIRT3起到了重要的保護作用。除此之外,在腎小管上皮細胞中,AngⅡ可以減少SIRT3 mRNA的表達水平,這種作用可以被AngⅡ受體拮抗劑所阻斷。在腎臟足細胞中,尼可地爾可以增加SIRT3的表達。雖然SIRT3已被報道在許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著不可或缺的作用,但是SIRT3對高血壓引起的腎臟損害以及足細胞損傷的作用仍不清楚。研究目的:1.探討SIRT3在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達變化;2.探討SIRT3是否參與調(diào)節(jié)高血壓小鼠的腎臟損害過程;3.探討SIRT3對高血壓引起的足細胞損傷的影響。研究方法:1.實驗動物及分組:SIRT3-KO小鼠購自美國Jackson實驗室,基因背景為129S6/SvEvTac。8周齡雄性129野生型小鼠購自北京大學(xué)動物研究所。SIRT3過表達小鼠通過對129野生型小鼠進行尾靜脈注射SIRT3過表達慢病毒而獲得。所有動物實驗均符合國家衛(wèi)生部動物管理辦法(documentation No 55,2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。將實驗動物90只隨機分為六組:正常對照組;AngⅡ組;SIRT3-/-+生理鹽水組;SIRT3-/-+AngⅡ組;SIRT3過表達+生理鹽水組;SIRT3過表達+AngⅡ組。2.構(gòu)建小鼠高血壓模型:將預(yù)先灌滿適當(dāng)劑量血管緊張素Ⅱ的微量滲透泵分別埋入野生型小鼠、SIRT3-KO小鼠、SIRT3過表達小鼠皮下,持續(xù)泵入AngⅡ 42天,泵速為2000ng/Kg/min,造成高血壓小鼠模型,對照組泵入相同劑量的無菌生理鹽水。實驗結(jié)束時,取材小鼠腎臟皮質(zhì)進行研究。分別于實驗前和實驗結(jié)束時測量小鼠血壓,留取小鼠尿液及血液進行相關(guān)腎臟功能指標(biāo)檢測。3.腎臟功能檢測:將留取的血液及尿液離心后,取上清,分別用Elisa方法檢測尿蛋白及肌酐水平,血肌酐及尿素氮等腎臟功能指標(biāo)。4.組織免疫染色:取材后,組織切片分別進行過碘酸-雪夫(periodic acid schiff,PAS)染色,觀察腎小球硬化情況;Masson染色,觀察腎臟間質(zhì)纖維化情況;免疫組織化學(xué)染色觀察纖維化相關(guān)分子的表達情況,并采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0)進行定量分析。5.透射電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu):腎臟取皮質(zhì),用2.5%的戊二醛固定后,利用透射電子顯微鏡(TEM,H-7000FA,Hitachi,Tokyo,Japan)觀察腎小球足突。6.細胞培養(yǎng)及處理:體外培養(yǎng)小鼠永生化足細胞系(MPC-5)。于5%CO2、33°C培養(yǎng)箱增殖,5%C02、37°培養(yǎng)箱分化。分化成熟的足細胞進行鑒定后,用于后續(xù)實驗,進行SIRT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染等處理,給予體外培養(yǎng)的足細胞AngⅡ(10-6M)刺激 48h。7.蛋白質(zhì)免疫印跡分析:腎臟皮質(zhì)組織或細胞用裂解液裂解后,提取總蛋白。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,封閉后孵育特異性一抗4°搖床過夜,第二天孵育二抗后,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,利用化學(xué)發(fā)光儀顯影目的蛋白,并用Image J軟件進行灰度值分析。8.免疫熒光染色:細胞用4%多聚甲醛固定,TritonX-100打孔后,封閉30分鐘,滴加相應(yīng)濃度的一抗,4℃孵育過夜。PBS清洗一抗后,孵育FITC或TRITC標(biāo)記的二抗,經(jīng)DAPI染核后,封片拍攝。9.統(tǒng)計學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用GraphPad Prism 6軟件進行。兩組間采用獨立樣本t檢驗,多組間采用One-way ANOVA檢驗。P0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果:1.高血壓小鼠行臟皮質(zhì)中SIRT3的表達水平下降Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)的SIRT3水平明顯下降。組織免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),高血壓小鼠腎小球SIRT3表達明顯減弱。此結(jié)果提示,SIRT3的表達水平在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中降低。2.SIRT3調(diào)節(jié)了高血壓小鼠腎臟功能我們檢測腎臟功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn):1.高血壓小鼠與正常對照組小鼠相比,腎臟功能指標(biāo)明顯升高,腎臟功能受損;2.SIRT3-KO高血壓小鼠比野生型高血壓小鼠的腎臟功能受損更加嚴重;3.SIRT3過表達后,腎臟功能損害程度明顯減輕。提示:SIRT3可能參與調(diào)節(jié)了高血壓小鼠的腎功能。3.SIRT3參與調(diào)控高血壓小鼠腎臟纖維化PAS及Masson染色顯示:高血壓小鼠腎臟發(fā)生了明顯的腎小球硬化及間質(zhì)纖維化,并且這種變化在SIRT3-KO小鼠中更為嚴重;SIRT3過表達后,小鼠腎臟纖維化水平得到明顯改善。此外,我們檢測了腎臟皮質(zhì)中纖維化因子纖連蛋白及Ⅳ型膠原的表達,發(fā)現(xiàn)高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的纖維化因子水平升高,特別是在SIRT3-KO小鼠中升高更為明顯;SIRT3過表達后,纖維化因子的表達明顯下降。這些結(jié)果提示:SIRT3可能參與了高血壓小鼠腎臟纖維化的過程。4.SIRT3介導(dǎo)了高血壓狀態(tài)下腎小球足細胞損傷的調(diào)控透射電鏡結(jié)果顯示,高血壓小鼠腎小球足突發(fā)生融合,SIRT3基因敲除后,這種融合更加嚴重,甚至發(fā)生斷裂,并且腎小球基底膜電子密度增高。值得注意的是,SIRT3過表達高血壓小鼠腎小球中,足突融合程度明顯減輕,腎小球基底膜電子密度正常。結(jié)果提示:SIRT3可能參與了高血壓小鼠腎小球足細胞損傷的調(diào)控。5.足細胞中,SIRT3降低了 AngⅡ引起的纖維化因子的表達研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)的足細胞中,AngⅡ刺激引起了 SIRT3表達減少,纖連蛋白和IV型膠原的表達升高,抑制SIRT3后,AngⅡ引起的纖維化因子的表達升高更為明顯。除此之外,僅在SRT3抑制后,與正常對照組相比,纖維化因子表達也增多,并且升高均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示:在腎臟足細胞中,SIRT3可能抑制了纖連蛋白和IV型膠原的表達。結(jié)論:1.SIRT3在高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中的表達減少;2.SIRT3參與調(diào)節(jié)高血壓小鼠的腎臟功能及腎臟纖維化;3.高血壓小鼠腎臟足細胞的損傷與足細胞中SIRT3的表達下降有關(guān)。研究背景:慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)是全球范圍的公共健康問題。高血壓是導(dǎo)致慢性腎臟病的主要原因之一。高血壓腎損害的主要病理基礎(chǔ)是腎臟纖維化,其特征包括腎小球硬化和腎臟間質(zhì)的纖維化。引起腎臟纖維化的機制非常復(fù)雜,目前尚未完全闡明。腎臟纖維化導(dǎo)致了腎臟功能的進一步受損以及終末期腎臟疾病的發(fā)生。至今為止,除了透析和腎臟移植外,終末期腎臟病的治療手段還是非常缺乏并且多是無效的。因此,不斷提升對高血壓腎臟損害發(fā)生發(fā)展機制的認識,對慢性腎臟病的預(yù)防及治療,發(fā)揮著極為重要的意義。SIRT3是位于線粒體的Sirtuins家族成員之一,在代謝、氧化應(yīng)激等方面起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。SIRT3對疾病過程的調(diào)控,大多是通過直接調(diào)節(jié)其底物的去乙�；癄顟B(tài),激活或抑制它們的活性而實現(xiàn)的。目前SIRT3的底物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少。但SIRT3是如何調(diào)節(jié)高血壓腎臟損害的,具體分子機制至今尚未明確。KLF15是豐富表達于腎臟和肝臟的轉(zhuǎn)錄因子。KLF15可以通過抑制細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的表達,減輕壓力負荷引起的心臟纖維化。在5/6腎臟切除的動物模型中,KLF15改善了腎臟間質(zhì)纖維化。但KLF15與SIRT3的關(guān)系,國內(nèi)外尚未見報道。有研究表明,補充NAD或者使用AICAR可以增加SIRT3的表達,保護器官免受損害。以增加SIRT3的表達及活性為目的的治療,極有可能會成為一種新的治療手段,但目前SIRT3的激活劑報道較少。和厚樸酚是從傳統(tǒng)中草藥中分離出的一種低分子多酚類化合物,具有多種藥理學(xué)活性,比如抗炎、抗氧化、抗血管生成以及抗癌。有研究表明,和厚樸酚可以通過激活SIRT3,從而抑制心肌肥厚。此外,在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureterealobstruction,UUO)模型中,和厚樸酚可以減輕腎小管的損傷,并抑制腎臟間質(zhì)纖維化的發(fā)生。在腎臟細胞中,和厚樸酚抑制了 TGF-β1引起的促纖維化因子的產(chǎn)生和ECM的累積。因此,本實驗我們將探討小鼠腎臟皮質(zhì)中和厚樸酚對SIRT3的作用,以及SIRT3的激活對高血壓腎損害的影響及可能的分子機制,為高血壓腎臟損害的治療提供新靶點。研究目的:1.探討SIRT3參與調(diào)控高血壓腎損害的潛在分子機制;2.探討小鼠腎臟皮質(zhì)和足細胞中和厚樸酚對SIRT3的影響;3.探討SIRT3的激活對高血壓腎損害的作用。研究方法:1.實驗動物與分組:129野生型小鼠購自北京大學(xué)動物研究所。所有動物實驗均符合國家衛(wèi)生部動物管理辦法(documentation No 55,2001)和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。實驗動物60只隨機分為四組:正常對照組;AngⅡ組;SIRT3激活組;SIRT3激活+AngⅡ組。2.構(gòu)建動物模型:給予129野生型小鼠腹腔注射和厚樸酚(25mg/Kg/天),構(gòu)建SIRT3激活組。皮下埋置AngⅡ微量滲透泵,持續(xù)泵入AngⅡ42天,泵速為2000ng/Kg/min,造成高血壓小鼠模型,對照組泵入相同劑量的生理鹽水。實驗結(jié)束,處以小鼠安樂死,取材小鼠腎臟皮質(zhì)進行纖維化等研究。并分別于實驗前和實驗結(jié)束時測量小鼠血壓,留取小鼠尿液及血液進行相關(guān)腎臟功能指標(biāo)檢測。3.腎臟功能檢測:留取血液及尿液離心后取上清,分別用Elisa方法檢測尿蛋白及肌酐水平,血肌酐及尿素氮水平,評估各組小鼠腎臟功能。4.組織免疫染色:取材后,組織切片分別進行過碘酸-雪夫(PAS)染色,觀察腎小球硬化情況;Masson染色,觀察腎臟間質(zhì)纖維化;對相關(guān)纖維化相關(guān)分子進行免疫組織化學(xué)染色,并采用自動圖像分析軟件(Image Pro Plus)進行定量分析。5.細胞培養(yǎng)及處理:體外培養(yǎng)的小鼠永生化足細胞系(MPC-5),于5%C02、33℃培養(yǎng)箱增殖,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱分化。分化成熟的足細胞進行SIRT3小干擾RNA轉(zhuǎn)染及AngⅡ刺激,和厚樸酚干預(yù)等處理,用于后續(xù)實驗。6.蛋白質(zhì)免疫印跡分析:提取腎臟皮質(zhì)組織或細胞蛋白,然后進行電泳。SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,封閉1h后,孵育特異性一抗4℃過夜,第二天孵育二抗,然后利用化學(xué)發(fā)光儀和ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的蛋白條帶。7.免疫沉淀反應(yīng):制備蛋白樣品后,去除非特異性結(jié)合,然后利用相應(yīng)的抗體,進行免疫沉淀,并用蛋白免疫印跡技術(shù)進行檢測。8.免疫熒光:細胞經(jīng)PBS清洗后用4%多聚甲醛固定,經(jīng)Triton X-100打孔、封閉后,滴加相應(yīng)稀釋濃度的一抗,4℃孵育過夜。第二天清洗一抗,并孵育FITC或TRITC標(biāo)記的二抗,經(jīng)DAPI染核后,封片拍攝。9.統(tǒng)計學(xué)分析:定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用GraphPad Prism 6軟件進行。兩組間采用獨立樣本t檢驗,多組間采用One-way ANOVA檢驗。P0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果:1.SIRT3通過去乙�；疜LF15,激活了 KLF15的抗纖維化作用KLF15是腎臟富集的一個抗纖維化因子,在足細胞中我們發(fā)現(xiàn)SIRT3可以和KLF15共定位并相互結(jié)合,抑制SIRT3表達后,KLF15的乙酰化水平明顯升高。給予足細胞AngⅡ刺激后,SIRT3與KLF15的結(jié)合能力及KLF15的去乙�；骄鶞p弱。此外,抑制KLF15的表達后,我們發(fā)現(xiàn)纖維化因子纖連蛋白和IV型膠原升高。提示:在足細胞中,SIRT3可能通過去乙酰化KLF15而激活它的抗纖維化作用。2.和厚樸酚增加了足細胞中SIRT3的表達水平Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予足細胞和厚樸酚干預(yù),SIRT3表達升高。而且經(jīng)和厚樸酚預(yù)處理后給予AngⅡ刺激,SIRT3表達高于AngⅡ刺激組。此結(jié)果提示,在腎臟足細胞中,和厚樸酚可以增加SIRT3的表達水平。3.SIRT3-KLF15信號通路的激活,抑制了足細胞中AngⅡ引起的纖維化變化為了進一步探討和厚樸酚對SIRT3-KLF15信號通路的影響,我們探究了足細胞中和厚樸酚干預(yù)后,KLF15的表達水平以及KLF15的去乙�；癄顟B(tài),發(fā)現(xiàn),給予和厚樸酚干預(yù)后,足細胞中KLF15的表達及其去乙酰化水平均增加,并且AngⅡ引起的纖連蛋白與Ⅳ型膠原的表達減少,提示:和厚樸酚可能激活了SIRT3-KLF15信號通路,抑制了 AngⅡ引起的纖維化因子的表達。4.SIRT3-KLF15信號通路的激活改善了高血壓小鼠腎臟功能我們檢測小鼠尿肌酐和尿白蛋白,小鼠血液肌酐和尿素氮水平。發(fā)現(xiàn):給予和厚樸酚治療后,高血壓小鼠腎臟功能明顯改善。提示:SIRT3-KLF15信號通路的激活可能對高血壓小鼠的腎功能起到一定的保護作用。5.SIRT3-KLF15信號通路的激活減輕了高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化我們檢測了 SIRT3-KLF15信號通路的激活對高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的影響,結(jié)果顯示:給予和厚樸酚治療的高血壓小鼠,腎小球硬化程度明顯減輕,膠原纖維明顯減少,腎臟間質(zhì)纖維化得到明顯改善。說明SIRT3-KLF15信號通路的激活可能抑制了高血壓小鼠腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。6.SIRT3-KLF15信號通路的激活降低了高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中纖維化因子的表達我們檢測腎臟皮質(zhì)中相關(guān)因子的表達發(fā)現(xiàn),給予和厚樸酚治療后,腎臟皮質(zhì)中SIRT3的表達升高,纖連蛋白和Ⅳ型膠原的表達明顯下降。結(jié)果提示:SIRT3-KLF15信號通路的激活可能抑制了高血壓小鼠腎臟皮質(zhì)中纖維化因子的表達。結(jié)論:1.SIRT3激活了 KLF15的抗纖維化作用;2.SIRT3-KLF15信號通路的激活,對高血壓小鼠腎臟損害發(fā)揮保護作用;3.和厚樸酚激活SIRT3-KLF15信號通路,可能作為臨床治療高血壓腎損害的新靶點。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R544.1;R692

【參考文獻】

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1 ;Honokiol inhibits arterial thrombosis through endothelial cell protection and stimulation of prostacyclin[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年09期

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本文編號：1527771