本文關(guān)鍵詞：血府逐瘀湯逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景高血壓是世界上常見(jiàn)的危害人類(lèi)健康的疾病,是誘導(dǎo)中風(fēng)、心肌梗死、血管疾病及慢性腎臟疾病的主要因素之一。高血壓是心肌纖維化病變的主要因素,可導(dǎo)致病理學(xué)特征的心肌損害。高血壓引起心臟壓力負(fù)荷持續(xù)增加,引發(fā)間質(zhì)和血管周?chē)z原纖維的過(guò)度增生和異常積累,最終導(dǎo)致心肌纖維化。心肌纖維化是慢性心臟病的一個(gè)重要組成部分,被越來(lái)越多地認(rèn)為在慢性心臟病的病程進(jìn)展中起重要作用。因此,預(yù)防和治療心肌纖維化具有巨大的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。目前認(rèn)為,心肌纖維化是多種常見(jiàn)的心臟疾病向終末期心臟病發(fā)展的一個(gè)必然過(guò)程,是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。心肌纖維化是決定心血管疾病預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵性的因素,形成的機(jī)制非常復(fù)雜,涉及多種細(xì)胞因子。其中研究較多的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p,它被公認(rèn)是器官纖維化的治療靶標(biāo)。TGF-β是擁有眾多細(xì)胞因子成員的大家族,研究較多的是其中重要的TGF-βs。在哺乳動(dòng)物中只發(fā)現(xiàn)了TGF-β2和TGF-β3這3種形式。其中TGF-β1主要有由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,在心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,’TGF-β,發(fā)揮促肌性成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、促膠原基因表達(dá)、促細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用,是最重要的促心肌纖維化的細(xì)胞因子之一。種種研究表明,病理性TGF-β,的增加在心肌纖維化的增殖和變異中起著關(guān)鍵的作用,抗TGF-β1的治療無(wú)疑將成為心肌纖維化防治的重要策略。近年來(lái)針對(duì)TGF-β1在心肌纖維化領(lǐng)域的治療研究已取得進(jìn)展,但是其臨床療效有待進(jìn)一步確認(rèn)。Smads為T(mén)GF-β信號(hào)通路中的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,它可以將TGF-β信號(hào)由細(xì)胞膜表面直接傳送到細(xì)胞核內(nèi)。TGF-β作為配體,與受體相結(jié)合后,激活Smads蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入核內(nèi),共同調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。哺乳動(dòng)物中的Smads蛋白至少有8種,按結(jié)構(gòu)和功能可分為3個(gè)亞型：(1)受體激活型Smads,包括了Smad1、2、3、5和8。(2)共同介質(zhì)Smads,在哺乳動(dòng)物中為Smad4 (3)抑制型Smads,包括了Smad6、7。TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各種類(lèi)型Smads分子之間作用精密協(xié)調(diào),共同完成了生理以及病理狀態(tài)下TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)。傳統(tǒng)中醫(yī)多采用中藥復(fù)方對(duì)患者進(jìn)行治療。當(dāng)前許多中醫(yī)療法的療效被證實(shí)是由多種因素介導(dǎo)的。這些藥方中的藥理活性成分許多已被探明,其中部分被報(bào)道對(duì)多種疾病有顯著的療效,例如腫瘤、炎癥、心血管疾病等。高血壓心肌纖維化屬于中醫(yī)理論中“心悸”、“喘證”、“水腫”等范疇。血府逐淤湯是由桃紅四物湯改進(jìn)而來(lái),由十一味中藥組成,近年來(lái)臨床上廣泛用于高血壓心臟病的治療。許多中醫(yī)學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道服用中藥方劑血府逐淤湯對(duì)治療高血壓相關(guān)癥狀諸如頭痛頭暈等療效顯著,然而這些復(fù)方的潛在作用機(jī)制和治療效果尚不清楚。研究目的本課題以白發(fā)高血壓大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,不同劑量血府逐淤湯予以灌胃給藥,觀測(cè)藥物對(duì)自發(fā)高血壓大鼠心肌纖維化的影響。檢測(cè)心肌組織中TGF-β及Smad2、3、7蛋白的表達(dá)情況,初步探究血府逐淤湯逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用機(jī)制。為臨床使用血府逐淤湯治療心肌纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法1.25只SHR大鼠隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組,每組5只,此外另設(shè)5只WKY大鼠為陰性對(duì)照組,共六組：(1)WKY對(duì)照組;(2)SHR對(duì)照組；(3) SHR+6g·kg-1血府逐淤湯組；(4) SHR+12g·kg-1血府逐淤湯組；(5) SHR+18g·kg-1血府逐淤湯組;(6)SHR+60mg·kg1卡托普利組。各組大鼠均灌胃給藥,WKY對(duì)照組和SHR對(duì)照組分別給予等量蒸餾水。每日上午10點(diǎn)整給藥一次,連續(xù)給藥16周。2.大鼠尾動(dòng)脈壓測(cè)量?jī)x檢測(cè)給藥前后尾動(dòng)脈收縮壓,探究藥物對(duì)SHR血壓的影響。3.將大鼠麻醉處死,采集心肌組織并做相應(yīng)處理,為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)樣本。4.樣本堿水解法檢測(cè)心肌組織羥脯氨酸含量,估算心肌膠原蛋白含量。5.心肌組織的固定及石蠟切片標(biāo)本的制作。6. Masson三色膠原染色進(jìn)行心肌組織病理學(xué)檢測(cè),計(jì)算膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)。7.免疫組化法觀測(cè)心肌組織中TGF-β1蛋白的分布及表達(dá)。8.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的 mRNA表達(dá)。9. Western blot法檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.藥物對(duì)大鼠血壓的影響SHR大鼠血壓顯著高于WKY大鼠,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)；灌胃給藥后卡托普利組大鼠血壓顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而其余各組血壓變化不明顯。2.心肌組織羥脯氨酸含量測(cè)定羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,根據(jù)其成色深淺可推算膠原含量。SHR對(duì)照組大鼠心肌組織羥脯氨酸含量顯著高于WKY對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)；卡托普利及高劑量血府逐淤湯組相對(duì)于SHR對(duì)照組羥脯氨酸含量顯著降低(P0.001)；中劑量血府逐淤湯組也能明顯降低羥脯氨酸含量(P0.05)；而低劑量血府逐淤湯組對(duì)羥脯氨酸影響不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3. MASSON三色膠原染色檢測(cè)心肌組織纖維化程度經(jīng)MASSON染色后,心肌膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)色,心肌肌纖維呈現(xiàn)紅色,胞漿呈藍(lán)黑色。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量并分析膠原面積,計(jì)算膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)(CVF)。SHR對(duì)照組CVF值顯著高于WKY對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；卡托普利組相對(duì)于SHR對(duì)照組CVF值顯著降低(P0.01)；高劑量血府逐淤湯組CVF值也能明顯降低(P0.05)；而低劑量及中劑量血府逐淤湯組CVF值相比SHR對(duì)照組差別不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4.免疫組化法檢測(cè)心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá)使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析,以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表現(xiàn),分別測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的累計(jì)光密度值(IOD)和分布面積(Area),計(jì)算出平均光密度值(Density),反映TGF-β1蛋白相對(duì)含量。SHR對(duì)照組TGF-β1蛋白含量顯著高于WKY對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；卡托普利及高劑量血府逐淤湯組相對(duì)于SHR對(duì)照組TGF-β1蛋白含量顯著降低(P0.05)；而低劑量及中劑量血府逐淤湯組TGF-.β1蛋白含量相比SHR對(duì)照組差別不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。5.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)Real Time PCR反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線、融解曲線及Ct值,使用2-△△Ct法計(jì)算各目標(biāo)基因的相對(duì)起始模板溶度。SHR對(duì)照組對(duì)比于WKY對(duì)照組,TGF-β1、Smad2、3的mRNA表達(dá)明顯升高,Smad7的mRNA表達(dá)含量明顯降低,具有顯著性差異(P0.05)；卡托普利組對(duì)比于SHR對(duì)照組,TGF-β1、Smad2、3的mRNA表達(dá)明顯降低,Smad7的mRNA表達(dá)含量明顯升高,具有顯著性差異(P0.05)；高劑量血府逐淤湯組對(duì)比于SHR對(duì)照組,TGF-β1、Smad2的mRNA表達(dá)明顯降低,Smad7的mRNA表達(dá)含量明顯升高,具有顯著性差異(P0.05),但Smad3的mRNA表達(dá)變化不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；低劑量及中劑量血府逐淤湯組對(duì)比于SHR對(duì)照組TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05)。6. Western blot法檢測(cè)心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)膠片進(jìn)行掃描,用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值,觀測(cè)各蛋白含量表達(dá)。SHR對(duì)照組對(duì)比于WKY對(duì)照組,TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明顯升高,Smad7蛋白含量明顯降低,具有顯著性差異(P0.05)；卡托普利組對(duì)比于SHR對(duì)照組,TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明顯降低,Smad7蛋白含量明顯升高,具有顯著性差異(P0.05)；高劑量血府逐淤湯組對(duì)比于SHR對(duì)照組,TGF-β1、Smad2蛋白含量明顯降低,Smad7蛋白含量明顯升高,具有顯著性差異(P0.05),但Smad3含量變化不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；低劑量及中劑量血府逐淤湯組對(duì)比于SHR對(duì)照組TGF-β1、 Smad2、Smad3、Smad7蛋白含量表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)血壓大鼠相比于wistar大鼠,收縮壓升高,心肌膠原蛋白含量增加,心肌組織中能觀察到顯著的纖維化病變,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)到一致。(2)高劑量組血府逐淤湯逆轉(zhuǎn)心肌纖維化效果顯著,但降壓效果不明顯,提示其逆轉(zhuǎn)心肌纖維化作用可能不是通過(guò)降低心臟壓力負(fù)荷實(shí)現(xiàn)的。(3)通過(guò)對(duì)心肌組織TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白含量表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高劑量組血府逐淤湯顯著降低TGF-β1、Smad2的表達(dá),Smad7表達(dá)明顯提升,初步證實(shí)其逆轉(zhuǎn)心肌纖維化作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smads通路實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：高血壓心肌纖維化血府逐淤湯 SHR TGF-β Smads
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-23
• 第二章 血府逐瘀湯逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制研究23-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-42
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-50
• 2.4 討論50-55
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 中英文縮寫(xiě)詞對(duì)照表59-60
• 碩士期間發(fā)表論文60-61
• 綜述61-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：955067