本文關(guān)鍵詞：小鼠燒傷后免疫相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)分析及生物標(biāo)志物的初步篩選

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【摘要】：[研究背景]燒傷,尤其是大面積燒傷將引起機(jī)體一系列的免疫病理生理學(xué)變化,造成機(jī)體免疫功能紊亂(immune dysfunction)。燒傷后免疫功能紊亂被認(rèn)為是引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、嚴(yán)重感染、多器官功能障礙綜合征(MODS)甚至死亡等的重要原因。燒傷后免疫功能紊亂是燒傷后創(chuàng)面疼痛刺激、應(yīng)激(stress)、缺血缺氧(ischemia、hypoxia)及再灌注損傷(reperfusion injury)等因素激活機(jī)體的凝血、纖溶、激肽和補(bǔ)體系統(tǒng),連同患者自身因素及后續(xù)的各種治療因素一起改變了機(jī)體免疫細(xì)胞和免疫分子所處的微環(huán)境,從而導(dǎo)致了免疫功能紊亂的發(fā)生。燒傷后免疫功能紊亂發(fā)生、發(fā)展機(jī)制極其復(fù)雜并難以得到有效調(diào)控,它也被認(rèn)為是近年來(lái)嚴(yán)重?zé)齻斡孰y以進(jìn)一步提高的主要原因。目前燒傷免疫研究多是對(duì)免疫細(xì)胞、免疫因子的作用機(jī)制或細(xì)胞凋亡、感染及器官損傷等方面的研究。這些研究或多或少的揭示了燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制。但是燒傷后的病理生理學(xué)變化是時(shí)間序貫性的,其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜幾乎涉及所有身體器官和系統(tǒng)。因此,深入研究燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制,對(duì)了解燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生發(fā)展、尋找治療及診斷的新藥物、提高患者生存質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,新的研究手段不斷涌現(xiàn)。尤其是在后基因組時(shí)代,系統(tǒng)性、整體性越來(lái)越受到人們的重視。因此,從基因組層次了解燒傷后的病理生理學(xué)過(guò)程將是今后燒傷免疫研究的重點(diǎn)。生物信息學(xué)(Bioinformatics)是生命科學(xué)領(lǐng)域中的新興學(xué)科,面對(duì)人類(lèi)基因組計(jì)劃所產(chǎn)生的海量生物學(xué)數(shù)據(jù),生物信息學(xué)成為當(dāng)代生命科學(xué)研究的一個(gè)前沿領(lǐng)域和重要的方法及工具。與生物信息學(xué)相伴發(fā)展的基因芯片技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一,是推動(dòng)生物學(xué)研究走進(jìn)系統(tǒng)生物學(xué)時(shí)代的重要因素和技術(shù)基礎(chǔ),它使得獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的能力大大增強(qiáng)。以基因芯片為代表的高通量分子生物學(xué)技術(shù),可以一次進(jìn)行成千上萬(wàn)基因表達(dá)的檢測(cè)�；蛐酒吧镄畔W(xué)技術(shù)為燒傷后免疫功能紊亂機(jī)制的研究提供新的研究前景,因其高通量的特性,它可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)以千計(jì)的基因表達(dá)情況,可以對(duì)燒傷后免疫細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄水平信息進(jìn)行分析,并對(duì)研究涉及的基因通路或者基因網(wǎng)絡(luò)、模塊的變化進(jìn)行分析挖掘�；蛐酒吧镄畔W(xué)技術(shù)為燒傷后免疫功能紊亂機(jī)制的研究及診斷提供了新的思路�；蛐酒夹g(shù)和生物信息學(xué)分析方法為從轉(zhuǎn)錄水平或DNA層次全面了解燒傷后復(fù)雜的病理生理學(xué)變化提供了可能。在2010年Lars H. Evers, Dhaval Bhavsar等人就已經(jīng)提出：燒傷后基因表達(dá)分析是未來(lái)一個(gè)潛在的研究熱點(diǎn),基因芯片從細(xì)胞整體基因組水平出發(fā),能為燒傷后免疫紊亂機(jī)制的研究提供新的思路及新的治療靶點(diǎn)。因此,進(jìn)行燒傷后基因表達(dá)分析,不僅可以從細(xì)胞整體基因組轉(zhuǎn)錄水平上了解燒傷后一系列的病理生理學(xué)變化,而且可以應(yīng)用基因芯片技術(shù)為臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)和思路。目前基因芯片技術(shù)應(yīng)用于燒傷領(lǐng)域的研究已比較常見(jiàn),2008年JamesA和Lederer等就利用基因芯片技術(shù)對(duì)創(chuàng)傷及燒傷后小鼠免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析中發(fā)現(xiàn)燒傷后可引起免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)等多個(gè)方面的變化。2010年Arul Jayaraman和Robert J等利用基因芯片技術(shù)對(duì)人燒傷后基因的序貫性變化做出了初步探究。通過(guò)對(duì)這些芯片數(shù)據(jù)的初步分析,發(fā)現(xiàn)了許多值得深思及顛覆性的信息,如燒傷與創(chuàng)傷、腫瘤不同；燒傷的時(shí)間序貫性強(qiáng)、反應(yīng)更復(fù)雜,涉及炎癥、免疫反應(yīng)、代謝等多方面因素。這些研究揭示了燒傷后免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化；并發(fā)現(xiàn)了許多與常規(guī)實(shí)驗(yàn)及臨床研究結(jié)果不同的結(jié)論,如創(chuàng)傷后免疫細(xì)胞基因改變?cè)缬?小時(shí)發(fā)生并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間；燒傷后基因變化是序貫性而且是有序進(jìn)行；燒傷后引起大量炎癥因子釋放,造成免疫細(xì)胞功能抑制,且發(fā)現(xiàn)固有免疫系統(tǒng)與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能抑制的發(fā)生無(wú)先后之分等。但目前大部分基因芯片研究多用于驗(yàn)證某些基因的表達(dá)情況,這一研究方法缺點(diǎn)較多,芯片數(shù)據(jù)可信度較差,無(wú)法進(jìn)行有效的數(shù)據(jù)挖掘與分析�，F(xiàn)階段燒傷相關(guān)的大規(guī)模芯片研究較少,在燒傷免疫方面的研究中更是少見(jiàn)。同時(shí)由于燒傷后病理生理學(xué)變化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制不同于腫瘤及其他疾病,其分析方法較為復(fù)雜、特殊�；蛐酒夹g(shù)在燒傷領(lǐng)域的應(yīng)用還處于初始階段,芯片產(chǎn)生的大量的數(shù)據(jù)并未得到很好的利用,且目前尚沒(méi)有對(duì)燒傷免疫基因芯片產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)方面的精細(xì)分析及挖掘。[研究目的]在本次研究中,我們通過(guò)系統(tǒng)生物信息學(xué)技術(shù)獲取小鼠燒傷早期不同時(shí)間點(diǎn)差異基因表達(dá)譜,并運(yùn)用生物信息學(xué)方法分別在GO語(yǔ)義、KEGG通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中初步探索燒傷后免疫功能改變的分子機(jī)制,并篩選潛在的生物靶標(biāo)。旨在初步探索和描述燒傷后免疫細(xì)胞差異表達(dá)譜、病理過(guò)程和分子機(jī)制；并通過(guò)富集分析錨定與燒傷后免疫功能紊亂發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因及通路；為深入研究燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制、并篩選早期預(yù)警指標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。[研究方法]1原始數(shù)據(jù)篩選從NCBI的GEO (Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選出GSE7404(小鼠,25%TBSA,三度)數(shù)據(jù)集,GSE7404數(shù)據(jù)是GPL1261平臺(tái)Affymetrix Mouse Genome 430 2.0Array基因芯片�；蛐酒瑪�(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)量評(píng)估合格后進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)處理。在R語(yǔ)言環(huán)境中應(yīng)用線性模型方法(linear models method)、經(jīng)驗(yàn)Bayes算法(empirical Bayes methods)和RSN (Robust Spline Normalization algorithm)分別對(duì)探針?biāo)降男盘?hào)值進(jìn)行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景矯正、數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋,將數(shù)據(jù)最終轉(zhuǎn)化為表達(dá)水平數(shù)據(jù)。2差異表達(dá)基因的獲取及聚類(lèi)分析：差異基因獲取采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),差異基因需同時(shí)滿(mǎn)足p-value0.01及表達(dá)量變化超過(guò)2倍的標(biāo)準(zhǔn),以確保所獲取的差異基因即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義又有生物學(xué)表達(dá)意義。同時(shí)通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析將差異基因進(jìn)行分類(lèi)。3功能富集分析在本次研究中,為我們應(yīng)用GO-function數(shù)據(jù)包可以對(duì)基因進(jìn)行功能注釋,以有效的處理GO功能中的冗余,使分析結(jié)果更加可靠精確。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。以篩選在對(duì)燒傷后免疫功能紊亂中重要的生物學(xué)過(guò)程及通路。4燒傷后第一天差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析將燒傷后第一天所獲取的差異表達(dá)基因應(yīng)用STRING9.1數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network)。網(wǎng)絡(luò)分析及MCL網(wǎng)絡(luò)模塊分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件。并應(yīng)用BinGO2.44對(duì)網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析。5免疫系統(tǒng)過(guò)程差異表達(dá)基因的篩選及原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建應(yīng)用DAVID網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能富集分析。選取EASE (Expression Analysis Systemic Explorer) 0.05的生物學(xué)功能,并將差異表達(dá)基因根據(jù)功能富集結(jié)果進(jìn)行分類(lèi)。原始差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建由DAVID及STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行。首先將不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因經(jīng)DAVID基因轉(zhuǎn)換工具(Gene ID Conversion Tool)進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換；將轉(zhuǎn)換后的基因輸入STRING9.1數(shù)據(jù)庫(kù)并選取中等可信度的互作關(guān)系(交互作用評(píng)分大于0.4)構(gòu)建差異表達(dá)基因的原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。6免疫相關(guān)基因的選取及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析將經(jīng)過(guò)Gene Ontology (GO)功能富集分析所選取的免疫系統(tǒng)過(guò)程相關(guān)基因映射到各時(shí)間點(diǎn)的原始蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建免疫相關(guān)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。免疫相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析及MCL網(wǎng)絡(luò)模塊聚類(lèi)分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件進(jìn)行,并應(yīng)用BinGO2.44對(duì)網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析。7小鼠燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)選用7-8周齡的雄性BALB/c小鼠20只,正常飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成四組。a組為正常對(duì)照組、37度溫水；b組為25%III。燙傷組；燙傷小鼠用1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,均剔除背毛,熱水燙傷,深度為(III。／深I(lǐng)I。)(病理證實(shí)),燙傷后即刻給予生理鹽水腹腔注射抗休克。正常組4只不做處理,直接處死取血；燙傷組分別在燙傷后2h、6h、12h、24h處死取血每組4只,Western blotting檢測(cè)小鼠全血游離免疫細(xì)胞中相應(yīng)的的蛋白表達(dá)水平。8統(tǒng)計(jì)分析采用開(kāi)源統(tǒng)計(jì)軟件R 3.01及SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。芯片數(shù)據(jù)處理及分析應(yīng)用開(kāi)源統(tǒng)計(jì)軟件R 3.01進(jìn)行。其中差異表達(dá)基因的獲取采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；基因本體學(xué)、KEGG通路分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析采用由超幾何算法及應(yīng)用Benjamini-Hochberg方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正。western blotting數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,配對(duì)樣本組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn),各組之間的比較采用One Way ANOVA方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]1統(tǒng)計(jì)分析總共有2725個(gè)差異表達(dá)基因被選出,在燒傷后2h組和燒傷后1d組差異表達(dá)基因以下調(diào)基因?yàn)橹?而燒傷后3d和7d組則以上調(diào)基因?yàn)橹?其中差異表達(dá)基因在小鼠燒傷后第1天變化最為顯著,共篩選出1825個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因658個(gè),下調(diào)基因1167個(gè)。在燒傷后2小時(shí)差異表達(dá)基因即發(fā)生明顯變化,同時(shí)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)燒傷后基因在轉(zhuǎn)錄層面的變化并不是雜亂無(wú)章的。2 GO功能富集分析結(jié)果燒傷后2h組下調(diào)基因富集于是免疫系統(tǒng)過(guò)程(p-value=4.27E-08)在燒傷后1d組上調(diào)差異表達(dá)基因富集于應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)(46%)、代謝過(guò)程(60%)、免疫系統(tǒng)過(guò)程(16.6%)、細(xì)胞過(guò)程(75.5%)、生物調(diào)節(jié)(58.4%)及死亡過(guò)程(18.2%)等生物學(xué)過(guò)程中；而下調(diào)基因明顯富集于細(xì)胞過(guò)程(56.8%)、代謝過(guò)程(47.1%)、應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)(25.7%)、免疫系統(tǒng)過(guò)程(13.2%)等四個(gè)生物學(xué)過(guò)程中。在燒傷后第3d組差異表達(dá)基因富集于應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)(43.8%)及免疫系統(tǒng)過(guò)程(18.1%)等生物學(xué)過(guò)程中。而燒傷后第7天上調(diào)基因富集于免疫系統(tǒng)過(guò)程(21.9%)、應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)(43.8%)及死亡(15.6%)等生物學(xué)過(guò)程中。3 KEGG通路分析在燒傷后2h組下調(diào)基因主要富基于免疫系統(tǒng)相關(guān)通路(Natural killer cell mediated cytotoxicity和T cell receptor signaling pathway)和信號(hào)分子及其相互作用相關(guān)通路(Cytokine-cytokine receptor interaction)。在燒傷后1d組有36個(gè)通路符合閾值要求并被顯著富集。上調(diào)基因富集通路主要為免疫系統(tǒng)相關(guān)通路(Toll-like receptor signaling pathway; NOD-like receptor signaling pathway; T cell receptor signaling pathway; RIG-I-like receptor signaling pathway等)；細(xì)胞過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡先關(guān)通路(p53signaling pathway; Apoptosis; Cell cycle);環(huán)境信息進(jìn)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)通路(MAPK signaling pathway; Jak-STAT signaling pathway; mTOR signaling pathway)。燒傷后1天下調(diào)基因主要富集與免疫相關(guān)通路(B cell receptor signaling pathway; Primary immunodeficiency; T cell receptor signaling pathway; Antigen processing and presentation; Natural killer cell mediated cytotoxicity等12個(gè)通路)及代謝相關(guān)通路中的氨基酸代謝(Valine, leucine and isoleucine degradation及Tryptophan metabolism)等通路相關(guān)。第3d組上調(diào)基因主要富集于代謝相關(guān)通路包括氨基酸代謝(Glutathione metabolism)核苷酸的代謝(Purine metabolism Pyrimidine metabolism)及碳水化合物代謝(Starch and sucrose metabolism)等,而第7d組上調(diào)基因主要富集于免疫系統(tǒng)相關(guān)通路(Toll-like receptor signaling pathway Hematopoietic cell lineage NOD-like receptor signaling pathway)及代謝相關(guān)通路(Glutathione metabolism, Nicotinate and nicotinamide metabolism Type Ⅱ diabetes mellitus等。4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析通過(guò)對(duì)燒傷后第一天的差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化分析顯示：Stat1 (down), Jun (up),Lck (down),Cd 19 (down),Sash3 (down),Chekl (up), Cd79a (down)等7個(gè)基因不僅在(1day)原始網(wǎng)絡(luò)中具有最大互作關(guān)系,而且在MCL網(wǎng)絡(luò)模塊中位于中心位置是潛在的治療靶標(biāo)。5免疫相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析,篩選出了不同時(shí)間點(diǎn)免疫系統(tǒng)功能相關(guān)差異表達(dá)基因,通過(guò)分析顯示：Lck, Myd88, Tlr2,Ccr2等4個(gè)基因在燒早期MCL網(wǎng)絡(luò)模塊中位于中心位置。并通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證了Myd88, Lck蛋白在小鼠燒傷早期免疫細(xì)胞的表達(dá)情況。[研究結(jié)論](1).燒傷后2小時(shí)小鼠免疫細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平即發(fā)生明顯變化,其中在燒傷后第1天變化最顯著,且這一變化并不是雜亂無(wú)章的,而是有一定規(guī)律可循的；(2).燒傷早期免疫細(xì)胞生物調(diào)節(jié)及死亡(凋亡)等生物學(xué)功能增強(qiáng)；燒傷早期免疫細(xì)胞即存在免疫系統(tǒng)過(guò)程、代謝過(guò)程、應(yīng)對(duì)刺激反應(yīng)、細(xì)胞過(guò)程等多種生物學(xué)功能的紊亂；其中免疫系統(tǒng)過(guò)程及刺激反應(yīng)等功能改變貫穿燒傷早期全程。(3). Statl, Jun, Lck, Cd19, Sash3, Chekl, Cd79a等7個(gè)基因可能在燒傷早期多功能紊亂的發(fā)生中起著重要的作用,是燒傷后多功能紊亂潛在的早期診斷的生物靶標(biāo)。(4). Lck, Myd88, Tlr2, Ccr2等4個(gè)免疫相關(guān)基因可能在燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過(guò)程中起著重要的作用,是燒傷免疫系統(tǒng)功能變化潛在的診斷與治療靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：差異表達(dá)基因 基因芯片分析 生物信息學(xué) 功能富集分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R644
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-27
• 參考文獻(xiàn)24-27
• 第一章 小鼠燒傷后免疫細(xì)胞多功能紊亂的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析分析27-54
• 一、材料與方法27-31
• 二、結(jié)果31-48
• 三、討論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 第二章 小鼠燒傷后蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及相關(guān)生物標(biāo)志物的初步篩選54-70
• 一、材料和方法55-56
• 二、結(jié)果56-63
• 三、討論63-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 第三章 小鼠燒傷后時(shí)序芯片數(shù)據(jù)分析及免疫標(biāo)志物的初步篩選70-92
• 一、材料和方法70-80
• 二、結(jié)果80-88
• 三、討論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-92
• 全文總結(jié)92-93
• 攻讀學(xué)位期間成果93-94
• 致謝94-95

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 尤元海;張建中;;基因表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)挖掘[J];中國(guó)生物工程雜志;2009年10期

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本文編號(hào)：944230