本文關鍵詞：血腫瘤屏障體外模型的建立及天然冰片對其調(diào)控的效果和機制研究

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【摘要】：目的：通過建立體外血腫瘤屏障模型(blood-tumor barrier,BTB),研究天然冰片開放血腫瘤屏障模型的時效、量效關系及對緊密連接蛋白的調(diào)控作用；進一步結合在體動物模型上,研究天然冰片提高抗腫瘤藥物透過血腫瘤屏障的藥效學研究,闡明天然冰片調(diào)節(jié)血腫瘤屏障開放的效果和機制,為臨床上神經(jīng)膠質(zhì)瘤等顱內(nèi)疾病的治療開辟-條新的途徑。方法：1.體外BTB細胞模型的建立大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)非接觸共培養(yǎng)建立體外BTB細胞模型,采用內(nèi)皮細胞跨膜阻抗(TEER)及HRP流量對模型性能進行評價。2.天然冰片藥材中右旋龍腦的含量測定采用氣相色譜法測定天然冰片藥材中右旋龍腦的含量。GC條件為：色譜柱：ZB-WAX毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱溫：梯度升溫,90℃保留2min,以10℃/min上升至110℃,保留2min,以30/℃/min上升至160℃,保留2min；進樣口：210℃；FID檢測器溫度：250℃；高純氮氣壓力：5psi；分流比：10：1；空氣流速：450mL/min;氫氣流速：45mL/min;進樣量：1μL。3.天然冰片對體外血腫瘤屏障模型通透性及緊密連接相關蛋白表達的影響實驗分4組：空白對照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組(100μg/mL),每組3個復孔。HRP流量測定不同劑量天然冰片對體外BTB細胞模型通透性的影響；免疫熒光及ELISA方法測定Claudin-5、Occludin、ZO-1、 F-actin的蛋白表達及分布變化。4.大鼠C6腦膠質(zhì)瘤在體模型的制備SD大鼠禁食不禁水12h,10%水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉,腦右側(cè)尾狀核狀處注射C6膠質(zhì)瘤細胞2.5×106(25μL),無菌骨蠟封閉骨孔,縫合皮膚,切口消毒,常規(guī)飼養(yǎng)。5.天然冰片對甲氨蝶呤在C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠體內(nèi)藥動學及腦組織分布的影響制備成功的C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠隨機分為溶媒對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉)、冰片低劑量組(35mg/kg)、冰片高劑量組(140mg/kg),每組28只。灌胃給藥(10mL/kg),1h后,3組大鼠均尾靜脈注射甲氨蝶呤(20mg/kg)。于甲氨蝶呤注射后的不同時間點取血及腦腫瘤組織,每個時間點血漿和腦組織的樣本均為4只大鼠。色譜條件：色譜柱Synergi Hydro-RP C18(250mm×4.6mm,4μm);流動相：甲醇-0.3%冰醋酸/0.25%三乙胺溶液(26：74)；流速：1mL/min;自動進樣器溫度：4℃；柱溫：35℃；檢測波長：302nm。結果：1.成功建立了體外BTB細胞模型,較好地反映了體內(nèi)的情況,可用于模擬體內(nèi)環(huán)境,用于藥物跨血腫瘤屏障特性方面的研究。2.本實驗所使用的天然冰片中右旋龍腦含量達到97.027%,符合中國藥典2010年版一部規(guī)定,可用于后續(xù)實驗研究。3.HRP流量測定天然冰片對體外BTB細胞模型通透性的影響,結果顯示：與空白對照組相比,天然冰片低劑量組(25μ/mL)、中劑量組(50μg/mL)、高劑量組(100μg/mL)的HRP通透率均隨著作用時間的延長逐漸提高,其中與空白組各相應時間點相比天然冰片低劑量組在10、30、60、120、240min時,通透率明顯提高,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)；中、高劑量組全部時間點的通透率明顯高于空白組各相應時間點的通透率,具有統(tǒng)計學意義；從不同組同一時間點的通透率可以看出,呈現(xiàn)劑量依賴趨勢,高劑量組(各時間點通遺率)中劑量組(各時間點通透率)低劑量組(各時間點通透率)。從相鄰時間點的透過率差值分析,低、中、高劑量組均在10-30min、30-60min時,HRP透過率提升最明顯,60-120min時通透率增加幅度降低,120-240min時,通透率恢復正常水平。4. ELISA方法及免疫熒光法測定體外血腫瘤屏障上緊密連接相關蛋白Claudin-5、 Occludin、ZO-1、F-actin的表達變化。ELISA測定結果顯示：Claudin-5蛋白的表達量隨作用時間的延長先降低,然后又逐漸升高恢復至藥前水平,在30min時表達量最低,并且在30、60min時間點存在劑量依賴性,高劑量(clandin-5)〈中劑量(Claudin-5)低劑量(Claudin-5)藥前(Claudin-5)oOccludin蛋白不同時間點間及不同組別間沒有顯著性的變化,表明天然冰片在25μg/mL-100μg/mL劑量范圍內(nèi),作用于BTB細胞模型4h,對Occludin蛋白的表達沒有顯著性的影響(P0.05)。天然冰片低劑量給藥后,Z0-1蛋白各時間點的表達量與給藥前相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；中、高劑量組ZO-1蛋白表達量先降低后又逐漸升高,且分別在60、30min時表達量最低(P0.01)。F-actin蛋白,各組表達量均先降低后逐漸升高,在30、60min時各組蛋白量顯著低于藥前表達量,差異具有統(tǒng)計學意義,并在30、60min時各組F-actin蛋白量存在劑量依賴趨勢高劑量(F-actin)中劑量(F-actin)低劑量(F-actin)藥前(F-actin)°免疫熒光法測定的四個蛋白的表達變化與ELISA實驗結果基本一致。5.成功制備大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型,并建立了測定血漿及腦組織勻漿液中甲氨蝶呤含量的HPLC法。與溶媒對照組比較,冰片高、低劑量組血漿中甲氨蝶呤AUC0-t,AUCO_。均顯著降低(P0.01)；冰片高劑量組腦腫瘤組織中甲氨蝶呤AUC0_t,AUCO-∞顯著升高(P0.05),冰片低劑量組腦腫瘤組織中甲氨蝶呤AUC0_t, AUC0-∞亦有升高趨勢,但與溶媒對照組比較無顯著差異(P0.05)。結論天然冰片通過調(diào)控相關緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的表達和分布的改變,從而調(diào)節(jié)體外BTB細胞模型的通透性；在體實驗進一步驗證了天然冰片能夠調(diào)節(jié)血腫瘤屏障的通透性,提高提高抗腫瘤藥物甲氨蝶呤的腦組織生物利用度。
【關鍵詞】：天然冰片 體外BTB細胞模型 緊密連接相關蛋白 甲氨蝶呤
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 第1章 文獻研究14-20
• 第1節(jié) 血腫瘤屏障14-16
• 第2節(jié) 構建體外BTB模型的方法16-19
• 1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)+C6膠質(zhì)瘤細胞16-17
• 2 鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(rBMECs)+C6膠質(zhì)瘤細胞17-18
• 3 人腦微血管內(nèi)皮細胞(hBMEC)+腦周細胞(PC)+U251膠質(zhì)瘤細胞(U251)18-19
• 第3節(jié) BTB模型評價方法19-20
• 1 電鏡觀察緊密連接19
• 2 液面滲漏試驗19
• 3 跨內(nèi)皮電阻19
• 4 通透性試驗19-20
• 第2章 實驗研究與結果分析20-63
• 第1節(jié) 體外BTB細胞模型的建立20-26
• 1 體外BTB細胞模型的建立20-26
• 第2節(jié) 天然冰片對體外BTB模型通透性及緊密連接蛋白的影響26-50
• 1 天然冰片藥材中右旋龍腦的含量測定26-30
• 2 天然冰片給藥劑量選擇30-33
• 3 HRP流量測定天然冰片對體外BTB模型通透性的影響33-36
• 4 ELISA方法測定天然冰片對體外BTB細胞模型緊密連接相關蛋白表達的影響36-42
• 5 免疫熒光法檢測天然冰片對體外BTB模型緊密連接蛋白表達和分布的影響42-50
• 第3節(jié) 天然冰片促進抗腫瘤藥物甲氨蝶呤透過血腫瘤屏障的藥效學研究50-63
• 1 大鼠C6腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立50-54
• 2 建立生物樣品中甲氨蝶呤含量測定的HPLC法54-59
• 3 天然冰片對甲氨蝶呤在大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型體內(nèi)藥動學的研究59-63
• 結語63-64
• 參考文獻64-68
• 附錄68-70
• 附錄Ⅰ 縮略語中英文說明68-69
• 附錄Ⅱ 在研期間發(fā)表的論文69-70
• 致謝70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 謝英,葉麗亞,張小濱,侯新樸,婁晉寧;血腦屏障體外實驗模型的建立[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2004年04期

2 楊海洋;蔡理;龍江;何吉洪;;應用U251膠質(zhì)瘤細胞、腦內(nèi)皮細胞和周細胞體外構建血瘤/腦屏障模型的研究[J];重慶醫(yī)學;2014年20期

3 胡野榮,鄧又華,姜志斌,吳忠仕;人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外分離培養(yǎng)的改進及其鑒定[J];醫(yī)學臨床研究;2005年05期

4 王秋艷;于煒婷;李雙月;王為;馬小軍;袁權;;微囊化培養(yǎng)肝癌細胞F-肌動蛋白分布特征[J];解剖學雜志;2006年02期

5 李維方,張光霽,朱誠,蔡如玨,王金林,盧亦成;立體定向大鼠C_6腦膠質(zhì)瘤動物模型的建立[J];立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志;2000年02期

6 沈大偉;陳磊;胡韶山;;腦膠質(zhì)瘤血腫瘤屏障特點的研究[J];腦與神經(jīng)疾病雜志;2013年01期

7 李明煥,田鏵,劉執(zhí)玉,宋濤,李貴寶,田廣平;ECV304細胞用于三維血管新生的研究[J];中國現(xiàn)代普通外科進展;2004年03期

8 賈鈺銘,丁正,曾令源,林渝峰,張文彬;冰片促進順鉑透過血腦屏障的實驗研究[J];四川醫(yī)學;2004年02期

9 張榮;段美美;;C6大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型建立及病理觀察[J];世界中西醫(yī)結合雜志;2013年01期

10 李鋒,楊小英,黨宏萬;毛細管區(qū)帶電泳法測定注射用甲氨蝶呤的含量[J];西北藥學雜志;2004年04期

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本文編號：924521