本文關(guān)鍵詞：循環(huán)血微小RNA作為急性肺動脈栓塞新型生物標(biāo)志物的實驗研究

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【摘要】：心血管系統(tǒng)疾病一直以來嚴(yán)重危害著人類的生命健康,由于冠狀動脈病變和腦血管意外在人群中具有較高的發(fā)病率和病死率,使得這兩種疾病已經(jīng)得到充分的重視,但人們對病死率緊隨這兩者之后的急性肺動脈栓塞(Acute Pulmonary Embolism,APE)的認(rèn)識和關(guān)注卻相對比較缺乏。肺栓塞由血栓、脂肪、羊水、空氣等各種栓子阻塞肺動脈系統(tǒng)后導(dǎo)致,其中以血栓栓塞最為常見,血栓來源于靜脈系統(tǒng)和右心,以下肢深靜脈來源最多見。栓子阻塞肺動脈及其分支后引起循環(huán)和呼吸功能障礙,急性肺血栓栓塞造成肺動脈較廣泛阻塞時,可引起肺高壓,嚴(yán)重時導(dǎo)致右心失代償、右心擴大,繼而出現(xiàn)急性肺源性心衰,最終可導(dǎo)致死亡。目前診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)為肺血管造影(Pulmonary Angiography,PA),該檢查屬于有創(chuàng)檢查,有發(fā)生致命性或嚴(yán)重并發(fā)癥的可能。計算機斷層攝影肺動脈造影術(shù)(Computed Tomographic Pulmonary Angiography,CTPA)是當(dāng)前最常用的APE確診手段,但對于腎功能不全和造影劑過敏的患者,該檢查的應(yīng)用受到限制。循環(huán)血中對APE診斷有一定參考意義的是血漿D-二聚體,但該指標(biāo)敏感性高特異性差,主要用于APE的排除診斷以及患者的危險分層。總之APE的診斷尚缺乏一種診斷效益高、無創(chuàng)的、廣泛適用、可快速獲取結(jié)果的方法。如果能在循環(huán)血中尋找到兼?zhèn)涓呙舾行院吞禺愋缘腁PE診斷標(biāo)志物,將為APE的早期快速診斷帶來希望。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一種小分子的非編碼RNA,它在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達發(fā)揮調(diào)控作用。研究證實mi RNA的表達具有組織和細(xì)胞特異性,在特殊情況下可以釋放入血,脫離細(xì)胞的mi RNA通過與蛋白類物質(zhì)或微泡等結(jié)構(gòu)相結(jié)合的形式逃避血液中RNA酶的降解從而穩(wěn)定地存在。這些特征使人們將循環(huán)血中mi RNAs水平的改變與某些疾病聯(lián)系起來,mi RNAs既可能在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中起到了調(diào)控作用,也可能直接由受損的病變組織釋放入血�；谝陨峡紤],研究者們開始探索循環(huán)血mi RNAs針對不同的疾病是否具有一定的診斷價值,目前相關(guān)的研究已經(jīng)從腫瘤快速擴展到多個疾病領(lǐng)域。在心血管領(lǐng)域研究較多的是循環(huán)血mi RNAs與心肌梗死、心衰等的關(guān)系,既往研究提示mi RNAs在心肌梗死的診斷中極具潛力。本實驗的目的在于初步探索循環(huán)血中mi RNAs是否具備成為診斷APE的生物標(biāo)志物的潛質(zhì)。一、急性肺動脈栓塞動物模型的建立研究目的:制備急性肺動脈栓塞大鼠模型。實驗方法:(一)將SD大鼠隨機分為6小組,分別為:正常組、APE后1h組、3h組、6h組、12h組、24h組,每組n=10。采用經(jīng)頸靜脈自體血栓注入法制備APE動物模型。(二)采集各組大鼠的血液樣本和肺組織樣本。(三)通過兩種方法驗證模型,分別是觀察APE模型組建模前后一般情況的改變和對比APE模型組與正常組的肺組織HE染色切片。實驗結(jié)果:APE建模的麻醉成功率為96.55%(56/58),栓塞成功率為89.29%(50/56)。建模后大鼠出現(xiàn)氣急、心率加快、口唇和皮膚紫紺等表現(xiàn),蘇醒后與造模前相比活動減少,納差,反應(yīng)遲鈍。正常組HE染色切片表現(xiàn)正常,APE組HE染色切片上可見血栓填塞肺動脈血管腔,肺組織不同程度的水腫和炎癥細(xì)胞浸潤,部分肺泡間隔增寬,肺泡壁連續(xù)性破壞,偶可見出血點。結(jié)論:通過選擇合適的實驗動物和造模方法,以及把握造模過程中的細(xì)節(jié)可以成功建立急性肺動脈栓塞動物模型。二、候選循環(huán)血mi RNAs在急性肺動脈栓塞動物模型中表達量的檢測研究目的:檢測候選循環(huán)血mi RNAs在APE動物模型中的表達情況,尋找對APE有診斷價值的循環(huán)血mi RNAs。實驗方法:(一)通過查閱文獻報道結(jié)合本實驗室前期的研究工作篩選循環(huán)血候選mi RNAs作為本實驗的檢測目標(biāo),確定合適的循環(huán)血mi RNAs內(nèi)參,標(biāo)化實驗結(jié)果。(二)選擇基于SYBR Green熒光染料的實時定量PCR反應(yīng)法,檢測候選mi RNAs在APE動物模型中的表達情況及其隨時間動態(tài)變化的趨勢。(三)采用ELISA法檢測動物模型血漿中D-二聚體水平及其隨時間的動態(tài)變化趨勢。(四)繪制接受者工作曲線(ROC curve)評價循環(huán)血mi R-195、mi R-486、D-二聚體以及mi R-195聯(lián)合D-二聚體對APE動物模型的診斷價值。實驗結(jié)果:(一)我們確定了以下13個循環(huán)血mi RNAs作為本實驗的候選mi RNAs:mi R-134、mi R-410、mi R-195、mi R-200c、mi R-486、mi R-146b、mi R-34b、mi R-192、mi R-363、mi R-328、mi R-26、mi R-101、let-7α。選擇mi R-16作為循環(huán)血mi RNAs定量PCR的內(nèi)參。(二)mi R-134、mi R-410、mi R-200c、mi R-34b、mi R-363、mi R-101信號值過低難以測出;mi R-195、mi R-192的表達量在APE發(fā)生后呈上升的趨勢,其中mi R-195的變化具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);mi R-486、let-7α的表達量在APE發(fā)生后有下降的趨勢;mi R-328、mi R-26、mi R-146的表達量在APE發(fā)生后未見明顯變化;進一步檢測目標(biāo)mi RNAs隨時間的變化趨勢,mi R-195在APE發(fā)生1h后表達量即顯著升高(P0.05),在APE發(fā)生6~12h時上升至最高,24h后開始下降;mi R-486在APE發(fā)生6h后表達量顯著下降(P0.05),APE發(fā)生12h時降到最低,24h時仍然保持在低水平;其余各mi RNAs在APE發(fā)生后表達量隨時間的變化不具有統(tǒng)計學(xué)意義。(三)D-二聚體的含量在APE發(fā)生后3h時顯著升高(P0.05),之后逐漸降低。(四)mi R-195繪制的ROC曲線下面積為0.956(P0.01),mi R-486繪制的ROC曲線面積下為0.740(P0.05),血漿D-二聚體繪制的ROC曲線下面積為0.861(P0.05)。當(dāng)mi R-195相對表達量為1.706時,其對APE動物模型診斷的特異性為100%,敏感性為80%。mi R-195聯(lián)合D-二聚體(APE 6h組)繪制的ROC曲線下面積為0.964(P0.01),當(dāng)診斷特異性為100%時,靈敏度為85.7%。mi R-195聯(lián)合D-二聚體(APE 3h組)繪制的ROC曲線下面積為0.813(P0.05),當(dāng)診斷特異性為100%時,靈敏度為62.5%。結(jié)論:(一)循環(huán)血mi R-195在急性肺動脈栓塞模型中表達量升高,并且在建模早期即有明顯升高,其含量隨時間呈動態(tài)變化趨勢。(二)循環(huán)血mi R-195對APE動物模型的診斷價值較高,當(dāng)聯(lián)合D-二聚體的時候診斷效能進一步提高,可能為臨床上開辟高效的APE診斷方法提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：急性肺動脈栓塞 循環(huán)血 miRNAs 標(biāo)志物
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563.5
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-16
• 第一部分 急性肺動脈栓塞動物模型的建立16-26
• 一、材料與儀器16-18
• 二、實驗方法18-21
• 三、實驗結(jié)果21-23
• 四、討論23-26
• 第二部分 候選循環(huán)血miRNAs在急性肺動脈栓塞動物模型中表達量的檢測26-46
• 一、材料與儀器26-27
• 二、實驗方法27-31
• 三、實驗結(jié)果31-40
• 四、討論40-46
• 全文小結(jié)46-47
• 參考文獻47-53
• 綜述53-65
• 參考文獻60-65
• 科研工作及發(fā)表論文65-66
• 致謝66

【共引文獻】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 孟劉坤;分泌型蛋白質(zhì)NBL1在體—肺分流性肺動脈高壓中的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 劉傳振;hHIF-1α基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療高動力性肺動脈高壓的實驗研究[D];山東大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭杰;MicroRNA-370在高頻脈沖電磁場下對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增值調(diào)控作用的初步研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

2 金迪;不同粗飼料及蛋白質(zhì)來源日糧條件下奶牛瘤胃細(xì)菌群落多樣性變化[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

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本文編號：906715