本文關(guān)鍵詞：JNK1與TIPE2在感染后膈肌無力發(fā)生中調(diào)控機制的研究

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【摘要】：背景在人體與呼吸有關(guān)的呼吸肌中,膈肌(diaphragm)是最重要的,呼吸肌功能的60%~80%都是由膈肌完成的,所以膈肌對于維持生物體的呼吸功能具有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn),機體在受到病毒、細菌等引起的感染時會引起膈肌收縮功能障礙,出現(xiàn)無力現(xiàn)象,但是對于該現(xiàn)象的機制一直沒有研究清楚。臨床上造成感染的可能原因比較廣泛復(fù)雜,比如胸腹部感染,敗血癥和感染性休克等,我們課題組一直從事于膈肌無力機制的研究,對于LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥型大鼠中膈肌功能障礙研究具有一定前期基礎(chǔ),對于其相關(guān)發(fā)生機制的研究是本實驗的主要目的。根據(jù)本組之前研究的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)JNK1通路在膈肌無力的發(fā)病過程中具有明顯作用,據(jù)此本實驗利用LPS(Lipopolysaccharide)作用于大鼠造成感染,構(gòu)建大鼠膈肌肌無力模型,研究LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥大鼠中可能導(dǎo)致膈肌功能障礙的有關(guān)蛋白的表達及其變化情況,同時腹腔注射SP600125(JNK1抑制劑),觀測JNK1通路被抑制之后,大鼠膈肌的有關(guān)功能是否得到保護,大鼠膈肌的收縮功能是否得到某種程度上的恢復(fù)。TIPE2作為免疫負調(diào)控因子在炎癥的過程中起到非常重要的作用,本實驗同時對TIPE2等基因做了檢測,以期闡明JNK1通路中有關(guān)蛋白的表達情況以及TIPE2基因在膈肌無力中起到的作用。目的構(gòu)建內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌無力模型,研究JNK1通路有關(guān)蛋白以及TIPE2基因在膈肌無力中的作用,同時構(gòu)建小鼠骨骼肌細胞C2C12細胞LPS感染模型,進一步研究JNK1通路的有關(guān)調(diào)控機制。方法雄性SD大鼠40只,精神狀態(tài)良好,體重180~220g,用隨機分組的方法分為對照組、LPS模型組以及LPS+SP600125(JNK1抑制劑)組。給藥方法:對照組的10只大鼠給予腹腔注射生理鹽水;LPS組15只,腹腔(i.p)注射LPS(12mg/kg);LPS+SP600125組15只,腹腔(i.p)注射LPS的同時給予腹腔注射SP600125(30μM/kg)所有分組處理24h后處死;另外,每組皮下注射30ml/kg的生理鹽水。24h后將大鼠進行麻醉行氣管插管,記錄呼吸功能有關(guān)參數(shù)、對動脈血氣進行分析并且將大鼠膈肌離體分離制備膈肌肌條分別測定單收縮張力(Pt)同時測定最大強直張力(Po)、進而用Med Lab信號采集系統(tǒng)收集峰值收縮時間(CT)、半舒張時間(1/2RT)、張力最大上升速率(+d T/dtmax)、張力最大下降速率(-d T/dtmax)、張力-頻率曲線(Force-frequency curve)及疲勞指數(shù)(FI)的變化,同時收集膈肌標本用于Western Bolt、RT-PCR等實驗測定有關(guān)基因及蛋白的表達情況,并用HE染色和免疫組化的方法觀察膈肌組織的形態(tài)變化。構(gòu)建JNK1、TIPE2過表達和沉默質(zhì)粒,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠骨骼肌細胞C2C12感染模型中利用Western Blot、RT-PCR以進一步探討JNK1通路、TIPE2基因在膈肌無力中的作用機制。結(jié)果(1)與對照組相比,LPS組大鼠無論在潮氣量還是肺通氣量及最大肺通氣量均明顯降低(P0.01)。LPS+SP600125組與LPS組比較各值均明顯提高(P0.01)。(2)與對照組相比,LPS組大鼠膈肌Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax明顯降低,CT、1/2RT明顯增高(P0.01)。LPS+SP600125組與LPS組比較,大鼠膈肌的Pt、Po、+d T/dtmax、-d T/dtmax顯著提高(P0.01),CT、1/2RT明顯降低(P0.01);LPS+SP600125組與對照組比較,Pt、Po、CT、1/2RT、+d T/dtmax、-d T/dtmax差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)Western Blot顯示LPS組TIPE2、p-JNK的表達量明顯升高,而JNK1無明顯變化,LPS+SP600125組JNK1得到抑制之后,JNK1的激活體表達降低,TIPE2的表達表達亦呈現(xiàn)明顯的下降趨勢,RT-PCR得到一致結(jié)果。(4)利用HE染色方法顯示,對照組大鼠的膈肌肌纖維形狀較為規(guī)則,排列相對整齊,相比而言LPS組大鼠的膈肌肌纖維則呈現(xiàn)出走向紊亂狀況,甚至斷裂溶解,間質(zhì)水腫。(5)免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在LPS組的表達明顯高于Control組,顏色較深,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),JNK1的檢測結(jié)果顯示無明顯變化。(6)不同時間點的C2C12肌細胞感染模型顯示,p-JNK、TIPE2隨著LPS刺激時間的增加表達增多,24h之后表達會下降。之后又構(gòu)建JNK1、TIPE2過表達載體轉(zhuǎn)染至C2C12細胞,利用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),兩者的表達趨勢呈正相關(guān)性,這與動物模型實驗結(jié)果一致。結(jié)論1、內(nèi)毒素血癥大鼠出現(xiàn)膈肌無力表現(xiàn),注射SP600125之后膈肌功能得到改善,SP60125可能對膈肌具有一定的保護作用。2、LPS刺激大鼠之后可以激活JNK1通路,p-JNK、TIPE2表達升高;JNK1被抑制之后,p-JNK、TIPE2表達下降,膈肌收縮能力恢復(fù),提示大鼠膈肌收縮能力的變化可能與JNK1通路的調(diào)控有關(guān)。3、JNK1與TIPE2存在正向調(diào)控關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：膈肌無力 JNK1 TIPE2 SP600125
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R565
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞表12-14
• 引言14-16
• 1 前言16-18
• 2 材料、儀器與試劑18-26
• 2.1 材料與試劑18-20
• 2.2 儀器20-21
• 2.3 部分溶劑配制方法21-26
• 3 實驗方法26-40
• 3.1 動物模型建立26
• 3.2 動物模型相關(guān)指標檢測26-28
• 3.3 總RNA的提取28-29
• 3.4 引物設(shè)計29-30
• 3.5 CDNA第一鏈的合成30
• 3.6 REAL- TIME PCR擴增目的基因30-31
• 3.7 蛋白質(zhì)的提取及BCA法測定蛋白濃度31-32
• 3.8 WESTERN BLOT蛋白凝膠電泳32-33
• 3.9 膈肌標本的免疫組化33-34
• 3.10 感受態(tài)的制備34
• 3.11 TIPE2過表達載體的構(gòu)建34-37
• 3.12 JNK1慢病毒載體以及TIPE2慢病毒載體的構(gòu)建37
• 3.13 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染37-38
• 3.14 統(tǒng)計學(xué)分析38-40
• 4 實驗結(jié)果40-50
• 4.1 動物模型的成功構(gòu)建40-42
• 4.1.1 各組大鼠一般情況40
• 4.1.2 呼吸功能的測定40
• 4.1.3 動脈血氣分析40-41
• 4.1.4 膈肌收縮特性41
• 4.1.5 膈肌耐力的變化41-42
• 4.1.6 膈肌肌張力-頻率關(guān)系42
• 4.2 形態(tài)學(xué)觀察以及部分基因檢測42-45
• 4.2.1 大鼠膈肌HE染色42-43
• 4.2.2 膈肌免疫組化結(jié)果43
• 4.2.3 WESTERN BLOT檢測部分蛋白質(zhì)表達43-45
• 4.2.4 REAL-TIME PCR檢測部分基因45
• 4.3 JNK1與TIPE2的相互調(diào)節(jié)關(guān)系45-50
• 4.3.1 LPS刺激之后不同時間點蛋白表達情況45-46
• 4.3.2 TIPE2過表達載體的構(gòu)建46-48
• 4.3.3 JNK1與TIPE2的表達相互調(diào)節(jié)關(guān)系48-50
• 討論50-54
• 結(jié)論54-56
• 參考文獻56-58
• 綜述58-70
• 參考文獻65-70
• 致謝70-72
• 在讀期間參加的學(xué)術(shù)會議及研究成果72-73

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