發(fā)布時(shí)間：2017-08-08 13:07

  本文關(guān)鍵詞：宿主因素對(duì)毛囊重建影響實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：一、研究背景在經(jīng)濟(jì)日益繁榮的今天,人們對(duì)美的要求越來越高。良好的外形不僅給人以舒適感,在工作中也會(huì)給自己帶來不少優(yōu)勢(shì)。毛發(fā)是人體美的重要組成部分,一頭烏黑亮麗的頭發(fā)不僅是年輕、健康的象征,更能增加人的美感。同時(shí)毛發(fā)有重要的生物功能如對(duì)身體的機(jī)械性保護(hù),防日曬、御寒,調(diào)節(jié)體溫,觸覺作用等。隨著現(xiàn)在生活節(jié)奏日益加快,工作、生活中的壓力逐漸增大,人們的生活習(xí)慣也發(fā)生巨大變化,脫發(fā)患者越來越多。脫發(fā)不僅使患者的生理功能受到一定影響,同時(shí)對(duì)患者的社會(huì)交往和心理健康造成了極大的負(fù)擔(dān)。目前脫發(fā)治療已成為熱點(diǎn)。根據(jù)不同病因,脫發(fā)可分為瘢痕性和非瘢痕性脫發(fā)。瘢痕性脫發(fā)有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等導(dǎo)致的原發(fā)性瘢痕性脫發(fā)和由于先天性、遺傳性或者發(fā)育缺陷、感染、物理和化學(xué)損傷及免疫反應(yīng)等造成的非原發(fā)性瘢痕性脫發(fā)。非瘢痕性脫發(fā)主要有雄激素性脫發(fā)、斑禿、生長期脫發(fā)、休止期脫發(fā)、拔毛癖等。其中以雄激素性脫發(fā)最常見。脫發(fā)的治療包括非手術(shù)治療和手術(shù)治療。非手術(shù)治療可分為藥物治療、中醫(yī)治療、激光治療、假發(fā)、織發(fā)及其他修飾掩飾技術(shù)。非手術(shù)治療以藥物治療為主,使用的藥物主要是米諾地爾和非那雄胺。然而這兩種藥物只能暫時(shí)性延緩脫發(fā)的進(jìn)展,使已經(jīng)微型化的毛囊增粗,而且須長期用藥。如停止藥物的使用,脫發(fā)區(qū)毛發(fā)又會(huì)進(jìn)行微型化過程,且該方法對(duì)已沒有毛囊的頭皮沒有作用。手術(shù)治療以自體毛發(fā)移植技術(shù)最常用。該方法是將后枕部優(yōu)勢(shì)供區(qū)的毛囊移植到脫發(fā)區(qū)域,實(shí)現(xiàn)毛囊的再分布。自體毛發(fā)移植技術(shù)是目前治療禿發(fā)唯一持久有效的方法,且很多禿發(fā)患者術(shù)后效果顯著。但該方法對(duì)于大面積禿發(fā)患者而言,存在供區(qū)不足問題。而再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,為解決這一問題提供了可能。為了實(shí)現(xiàn)毛囊再生,很多學(xué)者進(jìn)行了大量的研究,并取得了一定成果,分別在體內(nèi)和體外構(gòu)建出了毛囊再生模型。體內(nèi)毛囊重建模型主要有小室法、注射法、皮瓣法、三明治法、腎包膜法。小室法是在裸鼠背部做一深達(dá)肉膜的圓形創(chuàng)面,用一大小合適的鐘形硅膠室覆蓋全層創(chuàng)面并固定,將制成的細(xì)胞懸液注入小室內(nèi),3周后可觀察到新生毛發(fā)。但該方法動(dòng)物利用率較低,細(xì)胞用量大。注射法是直接把制備好的新生鼠的真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞混合后注射到裸鼠皮下,18天即可誘導(dǎo)出毛囊。雖然該方法提高了動(dòng)物利用率,減少了細(xì)胞使用量,但是新生毛囊方向雜亂無章。三明治法是指將新鮮分離的毛乳頭細(xì)胞置于分離的表皮和真皮層之間并將其植入皮下誘導(dǎo)毛囊再生,該方法操作較復(fù)雜。皮瓣法是由三明治法發(fā)展而來,在免疫缺陷小鼠背部做三邊開放的矩形皮瓣,將新鮮分離的胎鼠表皮置于硅膠板上,將分離的毛乳頭細(xì)胞移植到表皮上,把硅膠板放到皮瓣下,細(xì)胞面朝上,將切口縫合,待毛囊形成后將皮瓣翻轉(zhuǎn),移去硅膠板。該方法需要二次手術(shù)。腎包膜法是將真表皮細(xì)胞移植到腎臟包膜下誘導(dǎo)毛囊再生�；仡櫳鲜雒抑亟Ｐ筒浑y發(fā)現(xiàn)：在一定條件下,可以在動(dòng)物體內(nèi)人為地實(shí)現(xiàn)由“細(xì)胞—器官”的跨越,然而,動(dòng)物體內(nèi)參與該過程的因素相對(duì)較多且較為復(fù)雜,目前該發(fā)生機(jī)制并不清楚。因此上述體內(nèi)毛囊重建模型也僅僅適用于檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞的誘導(dǎo)能力,無法應(yīng)用于臨床。體外環(huán)境相對(duì)簡單,便于觀察毛囊再生的全部過程。因此,為了在體外實(shí)現(xiàn)毛囊再生,學(xué)者也同樣進(jìn)行了大量研究。目前,在體外可構(gòu)建出原始毛發(fā)樣結(jié)構(gòu)。但僅僅實(shí)現(xiàn)由“細(xì)胞—組織”的轉(zhuǎn)變。體外構(gòu)建的毛囊結(jié)構(gòu)形態(tài)較幼稚,需進(jìn)一步移植至體內(nèi)才能發(fā)育成完整毛囊。因此我們不難看出,目前的體外毛囊重建模型仍然太過簡單,不足以為毛囊再生提供適宜的微環(huán)境(細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號(hào)分子和營養(yǎng)物質(zhì)等),導(dǎo)致體外誘導(dǎo)的毛囊單位形態(tài)不成熟。已有大量研究證實(shí)脂肪細(xì)胞、毛囊間表皮干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等細(xì)胞成分,TGF、VEGF等生長因子及Wnt、BMP等信號(hào)分子對(duì)毛囊再生有重要作用。但是哪種成分起關(guān)鍵作用仍不得而知。因此我們以經(jīng)酶分離得到的新生鼠的細(xì)胞通過毛囊體內(nèi)重建模型先探究不同宿主對(duì)毛囊重建的影響,再研究宿主細(xì)胞是否參與了毛囊重建的過程,最后通過Cell-in-a-box試劑盒隔絕宿主細(xì)胞,探究在沒有宿主細(xì)胞參與的情況下毛囊重建的情況。以期通過上述研究對(duì)體外毛囊重建受限做出解釋,探究毛囊重建微環(huán)境,為將來的體外毛囊重建提供指導(dǎo)。一、不同宿主對(duì)毛囊重建的影響目的：明確不同宿主對(duì)毛囊重建的影響方法：取出生1天內(nèi)的GFP乳鼠,PBS(含1%青鏈霉素)清洗1次,剝離皮膚,PBS(含1%青鏈霉素)清洗3次。0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜,將表皮和真皮分離并分別剪碎,真皮用0.2%膠原酶37℃消化1小時(shí),每15分鐘吹打振蕩1次。表皮用0.25%胰酶37℃消化10分鐘。制備成新鮮分離的真皮和表皮細(xì)胞,加人DMEM高糖培養(yǎng)基重懸,細(xì)胞計(jì)數(shù)。取部分真皮、表皮細(xì)胞以2：1比例混合,表皮細(xì)胞分別為0.1×106個(gè)、0.5×106個(gè)、1.0×106個(gè)、2.5×106個(gè)。同時(shí),將剩余表皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞以不同的比例混合,分別為表皮細(xì)胞0.1×106個(gè)±真皮細(xì)胞1×106個(gè)、表皮細(xì)胞0.5×106個(gè)±真皮細(xì)胞1.0×106個(gè)、表皮細(xì)胞2.5×106個(gè)±真皮細(xì)胞1.0×106個(gè),表皮細(xì)胞0.5×106個(gè),真皮細(xì)胞1×106個(gè),各組細(xì)胞組合均以100ul高糖DMEM重懸,且100u1為1個(gè)單位,備好細(xì)胞懸液待注射。無菌條件下注射于裸鼠及脫去背部毛發(fā)的C57BL/6鼠背部中線兩側(cè)。每只鼠注射6個(gè)點(diǎn)。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化。于術(shù)后2、4、7、14、18、21天移植部位取材,隨后每隔3天取材,直至觀察到新生毛囊重新進(jìn)入生長期,體視鏡下觀察,做石蠟、冰凍切片,正置顯微鏡下觀察。取移植后21天形成的毛發(fā)做掃描電鏡檢查。將各細(xì)胞量組合的注射點(diǎn)在14天取材,對(duì)形成的毛發(fā)進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果：裸鼠和C57BL/6鼠體內(nèi)均可形成新的毛囊,新生毛囊在誘導(dǎo)階段大致相同,4天有黑色毛球形成,7天形成毛干。但C57BL/6鼠新生毛囊在18天進(jìn)入退行期,而裸鼠在21天。C57BL/6鼠新生毛囊在33天重新進(jìn)入生長期,裸鼠則在39天。石蠟切片見再生毛囊結(jié)構(gòu)完整,冷凍切片熒光檢測(cè)見明亮綠色熒光。細(xì)胞以不同的比例移植后發(fā)現(xiàn),C57BL/6鼠體內(nèi)毛囊重建效率高于裸鼠,且二者的真表皮細(xì)胞的最佳比例不同,單一細(xì)胞移植至兩種鼠體內(nèi)時(shí)均無毛發(fā)形成。裸鼠體內(nèi)形成毛發(fā)直徑與正常毛發(fā)相近,但明顯較C57BL/6鼠體內(nèi)形成毛發(fā)直徑粗。結(jié)論：以兩種不同種系的老鼠作為宿主,通過注射法重建毛囊,兩種老鼠體內(nèi)毛囊重建效率不同,且重建毛囊的生長周期和毛干的直徑也有明顯差異,宿主因素對(duì)毛囊的形態(tài)發(fā)生有重要影響。二、毛囊重建過程中宿主細(xì)胞的參與情況目的：明確非皮下注射時(shí)宿主細(xì)胞是否參與毛囊重建過程方法：取出生1d內(nèi)RFP乳鼠皮膚,PBS(含1%青鏈霉素)清洗,0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜,然后用顯微鑷將表皮和真皮分離并分別剪碎,真皮用0.2%膠原酶37℃消化1h,表皮用0.25%胰酶消化10mmin。消化結(jié)束后各加入等體積DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化,制備成新鮮分離的真皮和表皮細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)。將真皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞以2：1的比例混合,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107ml,100 ul為1個(gè)單位,備好細(xì)胞懸液待注射。GFP鼠麻醉后去除背部毛發(fā),常規(guī)消毒,將制備好的細(xì)胞懸液每次1單位,無菌條件下注射至肉膜下,每只鼠注射6個(gè)點(diǎn)作為對(duì)照。每天觀察注射部位皮膚的顏色變化,14d后取材,常規(guī)石蠟切片、HE染色、冰凍切片及DAPI染色,鏡下觀察。結(jié)果：注射后第4d可見注射部位皮膚變灰,并有輕微隆起。第8d,皮膚顏色加深,呈黑色。隨后由于RFP鼠自身毛發(fā)生長,不易觀察。第14d取材發(fā)現(xiàn),單獨(dú)注射表皮或者真皮細(xì)胞組未見毛發(fā)形成,表皮和真皮細(xì)胞混合注射可見大量毛囊形成,毛囊結(jié)構(gòu)完整。石蠟切片見肉膜完整,新生毛囊位于肉膜下層。冰凍切片及DAPI染色可見新形成的毛囊中大部分為紅色熒光細(xì)胞,少部分為綠色熒光細(xì)胞。結(jié)論：利用兩種表達(dá)不同熒光蛋白的老鼠以注射法重建毛囊,通過觀察熒光細(xì)胞分布,發(fā)現(xiàn)重建的毛囊中有宿主細(xì)胞,即宿主細(xì)胞參與了毛囊重建過程。該方法簡化了操作過程,有較強(qiáng)特異性。但宿主細(xì)胞的具體來源仍不清楚,有待進(jìn)一步的研究。三、宿主細(xì)胞在毛囊重建中的作用目的：驗(yàn)證無宿主細(xì)胞參與下毛囊體內(nèi)構(gòu)建是否能夠完成方法：1.1將出生1d內(nèi)的GFP、RFP轉(zhuǎn)基因乳鼠處死后,于濃度為75%的乙醇中浸泡20S后,PBS(含1%青鏈霉素)清洗3次,剪去鼠尾巴和四肢后剝離皮膚,PBS(含1%青鏈霉素)清洗3次。0.1%中性蛋白酶4℃消化過夜,將表皮和真皮分離,并分別剪碎,真皮用0.2%膠原酶37℃消化1h,每15 min吹打振蕩1次。表皮用0.25%胰酶37℃消化10min。分別制備成分離的真皮和表皮細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)。1.2囊球的包裹 取RFP表皮細(xì)胞0.7×106,GFP真皮細(xì)胞1.4x106,按產(chǎn)品說明包裹細(xì)胞,包裹完成后用無菌的PBS反復(fù)清洗制備的囊球,備用。1.3囊球的體內(nèi)移植及體外培養(yǎng) 將裸鼠常規(guī)麻醉消毒,將含表皮和真皮細(xì)胞的囊球移植于裸鼠皮下,移植空白囊球作為對(duì)照,每只裸鼠移植一個(gè)點(diǎn),每點(diǎn)移植10個(gè)囊球,每組各6只裸鼠。剩余囊球置于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)基為(DMEM+10%FBS:Cnt07=2:1),將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期鏡下觀察囊球中細(xì)胞生長情況。1.420天后將部分體外培養(yǎng)的囊球中的細(xì)胞球取出重新接種,觀察細(xì)胞遷出情況；部分細(xì)胞球做常規(guī)石蠟切片,HE染色。剩余囊球繼續(xù)體外培養(yǎng)。10天后將體內(nèi)移植的部分囊球取材,鏡下觀察,將細(xì)胞球取出部分用于做常規(guī)石蠟切片,HE染色。剩余部分囊球繼續(xù)體內(nèi)培養(yǎng),40天后取材觀察。1.5將體內(nèi)移植10天后的囊球中的細(xì)胞球重新取出移植到裸鼠體內(nèi),觀察毛發(fā)形成情況。1.6用RFP乳鼠真皮和表皮細(xì)胞重復(fù)上述步驟,將體內(nèi)移植10天后的囊球中的細(xì)胞球重新取出移植到GFP鼠體內(nèi),觀察毛發(fā)形成情況。結(jié)果：包裹的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)逐漸發(fā)生聚集,形成細(xì)胞球,于包裹后第10天細(xì)胞球形態(tài)趨于穩(wěn)定,石蠟切片未見明顯分化現(xiàn)象。將形成的細(xì)胞球重新接種于培養(yǎng)基中,細(xì)胞球中的細(xì)胞可重新貼壁遷出。移植至裸鼠體內(nèi)的囊球于移植后10天取材,發(fā)現(xiàn)囊球保存完好,未發(fā)生破裂,顯微鏡下見囊球中的細(xì)胞發(fā)生聚集,形成細(xì)胞球,無明顯毛干,石蠟切片可見形成同心圓樣結(jié)構(gòu)。40天時(shí)仍未見明顯毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。將體內(nèi)移植的囊球中的細(xì)胞球取出后移植到體內(nèi)可見毛發(fā)形成。移植至轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)的細(xì)胞球形成的毛發(fā)中可見紅色熒光細(xì)胞。結(jié)論：新生鼠的真表皮細(xì)胞用cell-in-a-box試劑盒包囊后仍可以存活,該試劑盒可以較好地隔絕宿主細(xì)胞,隔絕宿主細(xì)胞后,無法成功誘導(dǎo)毛發(fā)再生,證明無宿主細(xì)胞參與條件下,體內(nèi)無法構(gòu)建成熟毛囊,宿主細(xì)胞是毛囊成熟所必需。
【關(guān)鍵詞】：毛囊重建 注射法 宿主 宿主細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R622
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-26
• 第一章 不同宿主對(duì)毛囊重建的影響26-35
• 1、材料和方法26-27
• 2、結(jié)果27-31
• 3、討論31-34
• 4、結(jié)論34-35
• 第二章 毛囊重建過程中宿主細(xì)胞的參與情況研究35-39
• 1、材料和方法35-36
• 2、結(jié)果36-37
• 3、討論37-38
• 4、結(jié)論38-39
• 第三章 宿主細(xì)胞在毛囊重建中的作用研究39-45
• 1、材料和方法39-41
• 2、結(jié)果41-43
• 3、討論43-45
• 4、結(jié)論45
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 綜述50-59
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 中英文對(duì)照表59-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間的成果60-61
• 致謝61-62

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本文編號(hào)：640117