發(fā)布時(shí)間：2017-07-03 05:09

  本文關(guān)鍵詞：牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷保護(hù)作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 牡荊苷 MCAO 抗氧化 抗炎(TLR-4 NF-κB TNF-α) EAA

【摘要】：腦血管病已成為當(dāng)今世界致死致殘的最主要疾病之一。目前對(duì)于腦缺血的治療效果均不能令人滿意。臨床上急需尋找高效低毒、促使血液再通、減輕缺血再灌致腦損傷的神經(jīng)保護(hù)劑。牡荊苷是傳統(tǒng)中藥金蓮花的主要活性成分,屬黃酮碳苷類(lèi)。課題組研究表明牡荊苷具有很好的體內(nèi)抗氧化和對(duì)衰老小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用。而牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷保護(hù)作用方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)以SD雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,采用Longa改良線栓法制造大鼠腦缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以牡荊苷為干預(yù)藥,依達(dá)拉奉為陽(yáng)性對(duì)照,研究牡荊苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。本研究為牡荊苷作為預(yù)防和治療腦血管病有效性藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為篩選抗腦缺血藥物提供新的方向。實(shí)驗(yàn)方法1.MCAO模型的建立采用Longa線栓法造模,缺血2h后進(jìn)行再灌注,待大鼠蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,驗(yàn)證造模成功。2.動(dòng)物分組及給藥將228只SD大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組,分別是假手術(shù)組(生理鹽水+溶劑),模型組(生理鹽水+溶劑),模型+依達(dá)拉奉陽(yáng)性對(duì)照組(3.24μmol·kg-1),模型+牡荊苷(1.62,3.24,6.48μmol·kg-1)不同劑量組,大鼠缺血再灌注后1h腹腔注射給藥,治療時(shí)間為1d和3d。3.牡荊苷對(duì)MCAO大鼠腦梗死體積的影響缺血再灌注大鼠治療1d后麻醉,斷頭取腦,冠狀位將其切成5等份,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(toronto transit commission,TTC)測(cè)定大鼠腦梗死體積。4.牡荊苷對(duì)mcao大鼠血腦屏障(bloodbrainbarrier,bbb)保護(hù)和抗氧化作用各組缺血再灌注大鼠治療1d和3d后麻醉,斷頭取腦,干濕重法測(cè)定腦組織含水量;免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮層水孔通道蛋白-4(aquaporin-4,aqp-4)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平;相應(yīng)試劑盒檢測(cè)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活力、活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)和丙二醛(malondialdehyde,mda)含量。5.牡荊苷對(duì)mcao大鼠抗炎作用各組缺血再灌注大鼠治療1d和3d后麻醉,斷頭取腦,免疫組化法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)皮層toll樣受體4(tolllikereceptor4,tlr-4),nf-κb(p65)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)水平;實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-timequantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr)檢測(cè)tlr-4mrna,nf-κb(p65)mrna的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)測(cè)定大鼠缺血側(cè)腦組織腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)。6.牡荊苷對(duì)mcao大鼠非抗氧化作用各組缺血再灌注大鼠治療1d和3d后麻醉,斷頭取缺血側(cè)腦組織,相應(yīng)試劑盒檢測(cè)一氧化氮(nitricoxide,no)含量和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,nos),na+-k+-atp酶活性;氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定腦組織缺血區(qū)谷氨酸(glutamate,glu),天冬氨酸(aspartate,asp)和甘氨酸(glycine,gly)含量。7.牡荊苷對(duì)mcao大鼠腦組織缺血區(qū)形態(tài)學(xué)作用各組缺血再灌注大鼠治療1d和3d后麻醉,斷頭取腦,he染色觀察大鼠缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài);透射電鏡下觀察大鼠缺血區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果1.mcao大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分依據(jù)longa等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),選取1~3分為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蟆Ｅc假手術(shù)組相比,缺血再灌注大鼠出現(xiàn)不能完全伸展手術(shù)對(duì)側(cè)前爪或向手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒等神經(jīng)缺損癥狀(p0.01),表明mcao模型制作成功。2.牡荊苷減少mcao大鼠腦梗塞體積與假手術(shù)組相比,模型組大鼠再灌注后缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷各給藥組均能有效減小腦梗死體積,并在一定劑量范圍內(nèi),具有劑量依賴(lài)性(p0.01,p0.05);與依達(dá)拉奉對(duì)照組相比,牡荊苷中、低劑量組作用較弱(p0.01,p0.05);牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異。3.牡荊苷對(duì)mcao大鼠bbb及抗氧化作用影響3.1牡荊苷減輕mcao大鼠腦水腫程度與假手術(shù)組相比,大鼠腦缺血再灌注后,缺血側(cè)腦組織含水量明顯增多(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組均能降低腦組織含水量,有顯著性差異,(p0.01,p0.05)且呈劑量依賴(lài)性;與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組作用較弱,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異;與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組降低腦水腫程度優(yōu)于1d,有顯著性差異(p0.05,p0.01)。3.2牡荊苷降低mcao大鼠aqp-4表達(dá)與假手術(shù)組相比,模型組大鼠缺血區(qū)腦組織aqp-4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組均能使aqp-4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)下降(p0.05,p0.01),且呈劑量依賴(lài)性;與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組作用較弱,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異;與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組下調(diào)aqp-4陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)程度優(yōu)于1d,有顯著性差異(p0.05,p0.01)。3.3牡荊苷可增加mcao大鼠sod活性,降低ros、mda含量與假手術(shù)組相比,模型組大鼠sod活性降低,ros和mda含量升高,均有顯著性差異(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組均能使sod活性升高,ros和mda含量降低,且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在保護(hù)sod活性、降低ros和mda含量上弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異:與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在保護(hù)sod活性、降低ros和mda含量上優(yōu)于1d,具有顯著性差異(p0.05,p0.01)。4.牡荊苷對(duì)mcao大鼠抗炎作用4.1牡荊苷減少缺血側(cè)皮層tlr-4和nf-κb陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組相比,模型組大鼠缺血區(qū)腦組織tlr-4與nf-κb(p65)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組均能使tlr-4和nf-κb(p65)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)下降(p0.05,p0.01),且呈劑量依賴(lài)性;與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組作用較弱,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異;與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組下調(diào)tlr-4和nf-κb(p65)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)程度優(yōu)于1d,有顯著性差異(p0.05,p0.01)。4.2牡荊苷減少缺血區(qū)腦卒中tlr-4和nf-κb(p65)mrna的表達(dá)與假手術(shù)組相比,模型組大鼠缺血區(qū)腦組織tlr-4和nf-κb(p65)mrna表達(dá)明顯升高(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組均能降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表達(dá),且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表達(dá)上弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異;與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在降低tlr-4和nf-κb(p65)mrna表達(dá)上優(yōu)于1d,有顯著性差異(p0.05,p0.01)。4.3牡荊苷減少大鼠缺血區(qū)腦組織tnf-α含量與假手術(shù)組相比,模型組大鼠tnf-α含量明顯升高,有顯著性差異(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組給藥后,tnf-α含量有所降低,且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在降低tnf-α含量上弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異:與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在降低tnf-α含量上優(yōu)于1d,具有顯著性差異(p0.05,p0.01)。5.牡荊苷對(duì)mcao大鼠非抗氧化作用5.1牡荊苷降低no含量、抑制nos活性與假手術(shù)組相比,模型組大鼠no含量及nos活性明顯升高,均有顯著性差異(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組給藥后,no含量及nos活性降低,且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在降低no含量及抑制nos活性上弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異:與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在降低no含量及抑制nos活性上優(yōu)于1d,有顯著性差異(p0.05,p0.01)。5.2牡荊苷增強(qiáng)na+-k+-atp酶活性與假手術(shù)組相比,模型組大鼠na+-k+-atp酶活性明顯降低,有顯著性差異(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組給藥后,na+-k+-atp酶活性有所升高,且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在提高na+-k+-atp酶活性上弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異:與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在提高na+-k+-atp酶活性上優(yōu)于1d,具有顯著性差異(p0.05,p0.01)。5.3牡荊苷可降低腦組織中興奮性氨基酸(excitatoryaminoacid,eaa)含量,增加抑制性氨基酸(inhibitoryaminoacid,iaa)含量與假手術(shù)組相比,模型組大鼠asp,glu含量明顯升高,gly含量明顯降低,均有顯著性差異(p0.01);與模型組相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組給藥后,asp,glu含量有所降低,gly含量有所升高,具有顯著性差異,且呈劑量依賴(lài)性(p0.05,p0.01);與依達(dá)拉奉相比,缺血再灌注大鼠治療1d和3d后,牡荊苷中、低劑量組在降低asp,glu含量,提高gly含量弱于依達(dá)拉奉對(duì)照組,有顯著性差異(p0.05,p0.01),牡荊苷高劑量組與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),無(wú)顯著性差異;與缺血再灌注大鼠治療1d相比,治療3d后,依達(dá)拉奉和牡荊苷治療組在降低asp,glu和升高gly含量上優(yōu)于1d,具有顯著性差異(p0.05,p0.01)。6.牡荊苷對(duì)大鼠缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)影響he結(jié)果顯示,假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,模型組細(xì)胞體積縮小、核固縮深染。各給藥組均能改善細(xì)胞病理形態(tài)。且在一定給藥劑量范圍內(nèi),隨著牡荊苷給藥濃度的增加,細(xì)胞深染與皺縮逐漸減輕,細(xì)胞形態(tài)明顯改善,具有劑量依賴(lài)性。并在一定時(shí)間范圍內(nèi),隨著牡荊苷給藥時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞病理形態(tài)明顯改善,具有時(shí)間依賴(lài)性。7.牡荊苷對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織海馬超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞核完整,核膜清晰,可見(jiàn)核孔,胞漿內(nèi)可見(jiàn)豐富的細(xì)胞器,海馬線粒體結(jié)構(gòu)清晰,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整,有較多的高爾基體與核糖體,1d和3d的超微結(jié)構(gòu)相同。腦缺血再灌注損傷模型組大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)顯著改變,腦缺血再灌注1d后神經(jīng)元細(xì)胞核中染色質(zhì)凝聚,胞質(zhì)腫脹,細(xì)胞器減少,部分線粒體峭損傷斷裂,線粒體基質(zhì)電子密度降低,部分線粒體腫脹,擴(kuò)張呈空泡狀。游離核糖體減少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒;腦缺血再灌注損傷模型組3d可見(jiàn)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核固縮,核膜溶解,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)高度水腫,細(xì)胞器明顯減少,線粒體結(jié)構(gòu)模糊,嵴數(shù)量減少或消失,部分線粒體外膜破裂,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈囊泡狀,且3d的比1d的損傷嚴(yán)重。在給藥之后,依達(dá)拉奉給藥組可以明顯改善腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu),且給藥3d比1d的作用好,結(jié)果顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞核質(zhì)腫脹減輕,可見(jiàn)線粒體結(jié)構(gòu)完整,胞漿空泡減少;隨著牡荊苷給藥濃度的增加,大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)明顯改善,具有劑量依賴(lài)性。并在一定時(shí)間范圍內(nèi),隨著牡荊苷給藥時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)元細(xì)胞核水腫減輕,雙層核膜結(jié)構(gòu)清晰,核周隙均勻,細(xì)胞器逐漸增加,線粒體嵴損傷減輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫程度逐漸減弱,具有時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)論:牡荊苷對(duì)MACO大鼠腦損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制主要是通過(guò)抗氧化應(yīng)激,抗炎癥反應(yīng),興奮性氨基酸毒性三條途徑實(shí)現(xiàn)的;牡荊苷中,低劑量組對(duì)MACO大鼠保護(hù)能力較弱,牡荊苷高劑量組保護(hù)能力與依達(dá)拉奉作用相當(dāng),且缺血再灌注大鼠治療3d效果優(yōu)于1d。
【關(guān)鍵詞】：牡荊苷 MCAO 抗氧化 抗炎(TLR-4 NF-κB TNF-α) EAA
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【目錄】：

• 中文摘要5-12
• 英文摘要12-19
• 英文縮寫(xiě)19-21
• 前言21-23
• 材料與方法23-32
• 結(jié)果32-38
• 附圖38-57
• 討論57-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 綜述 金蓮花藥理活性及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展71-80
• 參考文獻(xiàn)77-80
• 致謝80-81
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷81

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：512433