發(fā)布時(shí)間：2017-05-30 05:10

  本文關(guān)鍵詞：HMGB1介導(dǎo)的自噬在甘草酸干預(yù)Sunitinib心臟毒性的作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的蘇尼替尼(Sunitinib)在臨床治療晚期腎癌(ARCC)和胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)均有較佳的治療效果,是首個(gè)上市的多靶點(diǎn)受體酪氨酸激酶制劑。然而脫靶效應(yīng)造成的心臟毒性是該藥臨床應(yīng)用的主要限制因素之一,阻礙了Sunitinib在臨床中的廣泛應(yīng)用。探討研究Sunitinib心臟毒性的分子機(jī)制,尋找可行的保護(hù)性靶標(biāo)蛋白對(duì)于Sunitinib的臨床應(yīng)用有著十分重大的啟示作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Sunitinib作用心肌細(xì)胞能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生自噬,最終導(dǎo)致心肌損傷。為深入研究這一問題,本課題旨在研究Sunitinib誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的作用機(jī)制,回溯尋找介導(dǎo)自噬發(fā)生的關(guān)鍵靶標(biāo),針對(duì)靶標(biāo)尋找能夠保護(hù)Sunitinib誘導(dǎo)心臟毒性的抑制劑或激動(dòng)劑,為了Sunitinib心臟毒性保護(hù)提供數(shù)據(jù)支持,從而達(dá)到挖掘Sunitinib臨床應(yīng)用深度的最終目的。方法采用裸小鼠移植瘤模型、Sprague-Dawley大鼠模型、大鼠新生鼠原代心肌細(xì)胞,確認(rèn)Sunitinib在臨床治療劑量下產(chǎn)生明顯的心臟毒性,該心臟毒性伴隨有致死性的自噬發(fā)生。(1)采用SD大鼠模型,灌胃給予臨床治療轉(zhuǎn)移性腎癌劑量的Sunitinib 30天,通過檢測(cè)血清中心肌酶譜相關(guān)生化指標(biāo)肌激酶同工酶(CK-MB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)研究Sunitinib所誘發(fā)的心臟毒性。(2)檢測(cè)Sunitinib給藥后大鼠心電圖和超聲心動(dòng)圖的變化,確證Sunitinib作用下大鼠發(fā)生與臨床一致的心臟毒性變化。(3)采用786-0裸小鼠移植瘤模型,灌胃給予臨床治療腎癌劑量的Sunitinib,31天后從瘤重、腫瘤體積(TV)、相對(duì)腫瘤體積(RTV)等方面評(píng)估Sunitinib抗腫瘤能力。(4)對(duì)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)裸小鼠行心臟臟器指數(shù)分析,并在用心肌組織切片HE染色,探索Sunitinib在發(fā)揮抗腫瘤藥效時(shí)心臟毒性的發(fā)生情況。(5)透射電鏡(TEM)檢測(cè)大鼠心肌組織受Sunitinib影響下自噬的發(fā)生情況,以Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)情況。(6)運(yùn)用TEM再次確證原代心肌細(xì)胞中自噬的發(fā)生情況與發(fā)生強(qiáng)度。采用ICR小鼠模型、SD大鼠模型和大鼠原代心肌細(xì)胞模型,體內(nèi)外檢測(cè)甘草酸GA對(duì)Sunitinib心臟毒性的保護(hù)作用。(1)采用原代心肌細(xì)胞模型,以MTT法檢測(cè)GA保護(hù)下Sunitinib作用心肌細(xì)胞存活率的變化情況。(2)采用SD大鼠模型,灌胃給予臨床劑量的Sunitinib和GA 30天,尾靜脈取血,對(duì)大鼠CKMB、AST、LDH的血清指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)GA對(duì)Sunitinib心臟毒性的保護(hù)作用。(4)麻醉大鼠后進(jìn)行心電圖和超聲心動(dòng)圖檢測(cè),檢測(cè)在GA保護(hù)下Sunitinib誘導(dǎo)的心臟輸血功能減弱的變化情況。(5)取心臟組織作石蠟切片HE染色,觀察GA對(duì)Sunitinib心臟病理性變化的保護(hù)能力。采用SD大鼠模型、大鼠新生鼠原代心肌細(xì)胞,體內(nèi)外探索HMGB1介導(dǎo)的自噬在甘草酸干預(yù)Sunitinib心臟毒性的作用和分子機(jī)制。(1)采用原代心肌細(xì)胞和SD大鼠模型,以Western Blot法和TEM檢測(cè)甘草酸對(duì)Sunitinib觸發(fā)心肌自噬的影響。(2)采用原代心肌細(xì)胞和SD大鼠模型,以RT-PCR, Western Blot法和熒光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)Sunitinib對(duì)心肌組織和心肌細(xì)胞中HMGB1表達(dá)和亞細(xì)胞分布的影響。(3)采用大鼠新生鼠原代心肌細(xì)胞,運(yùn)用丙酮酸乙酯(EP)抑制HMGB1的核轉(zhuǎn)位能力,以免疫熒光檢測(cè)HMGB1的亞細(xì)胞分布,Western Blot法檢測(cè)HMGB1的亞細(xì)胞分布對(duì)sunitnib觸發(fā)自噬的影響,MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率變化情況。(4)運(yùn)用小分子RNA干擾技術(shù),沉默心肌細(xì)胞中的HMGB1蛋白表達(dá),Western Blot法和TEM檢測(cè)HMGB1的表達(dá)對(duì)sunitnib觸發(fā)自噬的影響,MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率變化情況。(5)采用原代心肌細(xì)胞和SD大鼠模型,以RT-PCR, Western Blot法和熒光共聚焦顯微技術(shù)檢測(cè)甘草酸對(duì)Sunitinib上調(diào)的心肌組織和心肌細(xì)胞中HMGB1表達(dá)和亞細(xì)胞分的影響。(6)采用Western Blot和免疫沉淀檢測(cè)方法,檢測(cè)Sunitinib作用下Beclinl蛋白表達(dá)水平變化,驗(yàn)證HMGB1與Beclinl的結(jié)合情況。(7)采用Western Blot和免疫沉淀檢測(cè)方法,檢測(cè)Sunitinib作用下Bcl2的磷酸化水平變化與HMGB1表達(dá)的水平之間的關(guān)系,和Bcl2與Beclinl的結(jié)合情況。(8)采用Western Blot和免疫沉淀檢測(cè)方法,檢測(cè)甘草酸對(duì)sunitinib引起的HMGB1與Beclinl結(jié)合增加、Bcl2與Beclinl結(jié)合減少的影響。結(jié)果1) Sunitinib在臨床治療腎癌劑量下誘導(dǎo)明顯的心臟毒性,并伴隨有自噬的發(fā)生。Sunitinib 100mg/kg灌胃給藥30天后,引起明顯心臟功能性變化,與對(duì)照組相比Sunitinib給藥組大鼠血清心肌酶譜CKMB、AST、LDH含量明顯增高,大鼠心電圖顯示R波振幅顯著降低,超聲心動(dòng)圖發(fā)現(xiàn)Sunitinib組大鼠室射血分?jǐn)?shù)與左室短軸縮短率出現(xiàn)功能性衰變現(xiàn)象,證實(shí)Sunitinib作用下心臟出現(xiàn)左室功能性影響,發(fā)生明顯心臟毒性。臨床換算100mg/kg的Sunitinib灌胃給藥31天,786-0移植瘤裸小鼠發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)出現(xiàn)明顯體重降低現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Sunitinib心臟臟器指數(shù)遠(yuǎn)小于正常組。心肌組織HE染色切片顯示Sunitinib組可見心肌細(xì)胞水腫,橫紋不清,排列紊亂,心肌病變表征明顯。對(duì)大鼠心臟組織的冰凍切片作透射電鏡,顯示Sunitinib組中出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,對(duì)該組織Western Blot檢測(cè)LC3表型,出現(xiàn)明顯Ⅱ型高表達(dá),指征自噬的發(fā)生。同時(shí)以梯度濃度Sunitinib作用原代心肌細(xì)胞,TEM顯示自噬體的形成,并伴隨有最終核膜破裂,細(xì)胞壞死的發(fā)生,說明Sunitinib作用下心肌細(xì)胞自噬并最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。2)GA干預(yù)Sunitinib心臟毒性的作用。體外試驗(yàn)以MTT法證明GA 50 μM能明顯回調(diào)Sunitinib 5 μM所引起的心肌細(xì)胞死亡。Sunitinib 100mg/kg和GA 10mg/kg灌胃30天后,尾靜脈取血,心肌酶譜結(jié)果表明GA能明顯保護(hù)Sunitinib誘發(fā)的CKMB, AST, LDH血清高濃度現(xiàn)象。心肌組織HE切片染色觀察可知GA能明顯減少Sunitinib誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞水腫,橫紋不清,排列紊亂等病理性心肌表現(xiàn)。心電圖顯示GA能有效保護(hù)Sunitinib作用下心肌組織出現(xiàn)的R波波幅下降現(xiàn)象。同時(shí)對(duì)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果分析可知GA作用下, Sunitinib誘發(fā)的左室射血分?jǐn)?shù)下降和左室短軸縮短率下降均可得到明顯的緩解。3)甘草酸通過抑制蘇尼替尼引起的HMGB1增高,降低HMGB1與Beclin1的結(jié)合,通過抑制Bcl2蛋白磷酸化增加Bcl2與Beclin1結(jié)合,干預(yù)蘇尼替尼觸發(fā)的心肌組織和心肌細(xì)胞自噬,發(fā)揮拮抗sunitinib心臟毒性的作用。Western blot法和TEM發(fā)現(xiàn)GA作用下原代心肌細(xì)胞的自噬和壞死得到下調(diào),大鼠心肌組織中自噬泡的形成也得以減少。證明GA抑制Sunitinib誘導(dǎo)的自噬,從而保護(hù)心臟避免Sunitinib引發(fā)的毒性。RT-PCR, Western Blot法和熒光共聚焦顯微技術(shù)顯示Sunitinib作用下,心肌組織和心肌細(xì)胞中HMGB1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平發(fā)生上調(diào),并由細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位。通過EP抑制HMGB1的核轉(zhuǎn)位,發(fā)現(xiàn)sunitnib觸發(fā)自噬受到抑制,心臟損傷得到緩解。運(yùn)用小分子RNA干擾技術(shù),沉默心肌細(xì)胞中的HMGB1蛋白表達(dá),顯示sunitnib觸發(fā)自噬受到抑制,心臟損傷得到緩解。甘草酸作用下可在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)sunitnib引起的HMGB1表達(dá)增高。細(xì)胞漿的HMGB1通過a)與Beclin1結(jié)合激活自噬；b)激活Bcl2的磷酸化,抑制Bcl2與Beclin1的結(jié)合,從而激活自噬。甘草酸通過抑制HMGB1的轉(zhuǎn)錄水平,a)阻斷其與Beclin1的結(jié)合；b)下調(diào)Bcl2的磷酸化,增加Bcl2與Beclin1結(jié)合,從而干預(yù)sunitnib引起的心肌自噬。結(jié)論：本論文在體內(nèi)模型證明Sunitinib發(fā)揮抗腫瘤作用劑量下能誘導(dǎo)明顯心臟損傷。天然來源的化合物甘草酸可干預(yù)sunitinib的心臟毒性。其作用機(jī)制是通過在轉(zhuǎn)錄水平抑制sunitnib上調(diào)的HMGB1,阻斷了其蛋白表達(dá)增加和核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而干預(yù)HMGB1與Beclinl的結(jié)合,阻斷Bcl2的磷酸化,增加其與Beclinl的結(jié)合,最終抑制sunitinib觸發(fā)的心肌自噬,為Sunitinib臨床應(yīng)用拓展了開發(fā)深度和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：蘇尼替尼(Sunitinib) 自噬 HMGB1 Beclin1 Bcl2 甘草酸(GA) 心臟毒性
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R96
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-11
• Abstract11-19
• 1 引言19-23
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑與材料23-30
• 2.1 藥物23
• 2.2 試劑23-25
• 2.3 各種自行配制溶液配方25-28
• 2.4 儀器28-30
• 3 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)30-32
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)32
• 3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染32-33
• 3.4 透射電鏡檢測(cè)酸性自噬泡33
• 3.5 MTT法檢測(cè)Sunitinib及合用GA對(duì)原代心肌細(xì)胞的抑制作用33
• 3.6 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平33-36
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-72
• 4.1 Sunitinib對(duì)786-0裸小鼠移植瘤具有生長(zhǎng)抑制作用36-38
• 4.2 Sunitinib發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)伴隨嚴(yán)重的心臟毒性38-39
• 4.3 Sunitinib在臨床劑量下可引起大鼠心臟損傷39-42
• 4.4 GA保護(hù)Sunitinib引起的心臟毒性42-48
• 4.5 Sunitinib在大鼠心肌組織中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生48-49
• 4.6 Sunitinib在原代心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬的發(fā)生49-51
• 4.7 GA抑制Sunitinib介導(dǎo)的心臟自噬發(fā)生51-53
• 4.8 Sunitinib作用下HMGB1發(fā)生高度表達(dá)和核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象53-57
• 4.9 抑制HMGB1核轉(zhuǎn)位可以減少Sunitinib誘導(dǎo)的自噬57-60
• 4.10 阻斷HMGB1的表達(dá)減少Sunitinib誘導(dǎo)的自噬60-62
• 4.11 GA在心肌細(xì)胞中通過抑制HMGB1降低Sunitinib誘導(dǎo)的自噬62-64
• 4.12 HMGB1可以通過與Beclin1結(jié)合誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬64-67
• 4.13 HMGB1促進(jìn)Bcl2磷酸化,導(dǎo)致心肌細(xì)胞Beclin1/Bcl2結(jié)合能力的下降67-72
• 5 討論72-76
• 參考文獻(xiàn)76-80
• 綜述80-97
• 參考文獻(xiàn)89-97
• 作者簡(jiǎn)歷及在讀期間所取得的科研成果97

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 段妍君;柯暉;陳澤斌;;電針內(nèi)關(guān)對(duì)室性期前收縮大鼠心植物神經(jīng)放電活動(dòng)的影響[J];湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2011年01期

  本文關(guān)鍵詞：HMGB1介導(dǎo)的自噬在甘草酸干預(yù)Sunitinib心臟毒性的作用及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：406446