本文關(guān)鍵詞：絲蛋白涂層彈簧圈可控釋放SDF-1α及其誘導(dǎo)EPCs參與大鼠動(dòng)脈瘤修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(Intracranial aneurysm, ICA)是指腦內(nèi)動(dòng)脈管壁的薄弱導(dǎo)致局限性囊性擴(kuò)張,是引起自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的最常見原因。傳統(tǒng)上顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)現(xiàn)多是由于動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血,其病程隱匿,起病突然,一旦破裂出血,其病死率高達(dá)25%～40%,致殘率約33%,再破裂出血病死率則高達(dá)40%～75%,嚴(yán)重威脅著人類的健康。因此,顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷一旦明確,應(yīng)引起足夠重視,針對破裂風(fēng)險(xiǎn)大的患者應(yīng)積極手術(shù)干預(yù),其目的是預(yù)防動(dòng)脈瘤破裂出血。目前,動(dòng)脈瘤的治療主要有顯微手術(shù)夾閉和血管內(nèi)介入治療兩種方式,且就開顱手術(shù)所造成的腦組織損傷而言,血管內(nèi)介入栓塞治療優(yōu)于顯微手術(shù)夾閉。血管內(nèi)介入栓塞治療動(dòng)脈瘤使破裂動(dòng)脈瘤的死亡率顯著降低,且患者依從性好,使絕對危險(xiǎn)度下降7.4%,導(dǎo)致癲癇發(fā)作的幾率降低。但目前臨床上常用的彈簧圈缺乏生物活性,栓塞術(shù)后動(dòng)脈瘤頸處內(nèi)皮覆蓋不全,可能導(dǎo)致動(dòng)脈瘤殘留或復(fù)發(fā)。為解決此問題,除尋找新的材料或設(shè)計(jì)各種復(fù)雜形狀彈簧圈外,對鉑金微彈簧圈的生物功能化可起到事半功倍的效果。自意大利學(xué)者Guglielmi(1989年)設(shè)計(jì)出電解可脫性微彈簧圈(Guglielmi detachable coil, GDC)以來,采用鉑金微彈簧圈經(jīng)動(dòng)脈介入栓塞治療動(dòng)脈瘤的技術(shù),以創(chuàng)傷小、恢復(fù)快、痛苦小、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的首選方案。彈簧圈應(yīng)用于血管內(nèi)栓塞治療動(dòng)脈瘤的機(jī)理主要是通過鉑金微彈簧圈的機(jī)械性填塞,閉塞瘤腔,改變局部血流動(dòng)力學(xué)因素,從而消除動(dòng)脈瘤破裂出血的風(fēng)險(xiǎn)。然而,標(biāo)準(zhǔn)鉑金GDC存在生物學(xué)惰性,動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)后不易誘發(fā)血栓和機(jī)化,持續(xù)的動(dòng)脈搏動(dòng)導(dǎo)致彈簧圈壓縮而再通。因此,與傳統(tǒng)的開顱夾閉手術(shù)相比,血管內(nèi)治療動(dòng)脈瘤仍存在較高的復(fù)發(fā)率。在國際上一些大規(guī)模的臨床研究中,通過數(shù)字減影血管造影(Digital subtration angiography, DSA)隨訪發(fā)現(xiàn),采用鉑金微彈簧圈栓塞治療動(dòng)脈瘤的復(fù)發(fā)率超過20%,部分病人尚發(fā)生中、遠(yuǎn)期再次破裂出血。為彌補(bǔ)目前GDC存在的不足,加速動(dòng)脈瘤腔的纖維化和瘤頸部位的內(nèi)皮覆蓋,如在利用生物可吸收的聚合物涂層彈簧圈基礎(chǔ)上負(fù)載某些細(xì)胞活化因子,使其在動(dòng)脈瘤內(nèi)隨聚合物材料的降解而控制釋放、緩慢表達(dá),提高微彈簧圈的生物活性作用,則有利于動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)后愈合過程,減少復(fù)發(fā)和再出血風(fēng)險(xiǎn)。最近幾年有研究表明：趨化因子在參與保護(hù)宿主、清除致病因子、炎性反應(yīng)及免疫系統(tǒng)自穩(wěn)等方面起作用,并且在心腦血管系統(tǒng)的發(fā)育以及損傷的修復(fù)等方面都發(fā)揮重要的作用。趨化因子即一類具有趨化作用,能夠趨化調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的細(xì)胞因子,而其受體則是介導(dǎo)趨化因子行使其生物學(xué)功能的GTP蛋白耦聯(lián)的跨膜受體,通常免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上有所表達(dá)�；|(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-la, SDF-1α)是一種具有趨化活性的因子,其為CXC亞家族成員,CXCR4為其受體,SDF-la能夠通過與細(xì)胞表面受體CXCR4特異性結(jié)合發(fā)揮作用。已有大量研究表明,SDF-1α及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)細(xì)胞的遷移。近期有研究表明,較原始的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)能夠表達(dá)SDF-1α的受體CXCR4,因此,SDF-la可趨化EPCs,促進(jìn)EPCs遷移、歸巢,并在局部分化為內(nèi)皮細(xì)胞。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一種可增殖、分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,生理情況下它主要參與血管的動(dòng)態(tài)維持和重建。但在病理?xiàng)l件下,機(jī)體自身的代償難以產(chǎn)生足夠的修復(fù)能力,尤其是存在缺血性心腦血管疾病危險(xiǎn)因素的患者,其EPCs的數(shù)量及生物學(xué)功能均顯著下降。研究證明EPCs的數(shù)量與Framingham心血管危險(xiǎn)系指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。這提示在體外富集、擴(kuò)增EPCs再自體移植以促進(jìn)血管修復(fù)或再生是一個(gè)積極有效的策略,EPCs也可以作為一種良好的種子細(xì)胞來源應(yīng)用于組織工程重建血管結(jié)構(gòu)。動(dòng)員和移植EPCs可提高缺血組織的血管增生能力,促進(jìn)血管的修復(fù)和再內(nèi)皮化。以EPCs移植治療各種血管性損傷模型,如腦缺血、肢體缺血、心肌梗塞、頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫等,已有了較多的報(bào)道。本研究旨在構(gòu)建一種負(fù)載SDF-1α的新型生物活性彈簧圈,在體內(nèi)能夠緩釋SDF-1α,當(dāng)涂層彈簧圈填塞大鼠動(dòng)脈瘤模型后,能夠促進(jìn)EPCs遷移、歸巢,促進(jìn)動(dòng)脈瘤內(nèi)皮增殖、瘤腔纖維化以及瘤頸部位的內(nèi)皮覆蓋,從而降低動(dòng)脈瘤栓塞后復(fù)發(fā)率。如何將SDF-la固定于鉑金微彈簧圈材料表面,并達(dá)到緩慢控制釋放也是本研究內(nèi)容之一。絲蛋白(Silk fibroin, SF)作為一種來源自然界、具有良好生物相容性、可降解性等優(yōu)點(diǎn)的生物材料,常用于組織工程研究。絲蛋白具有被誘導(dǎo)發(fā)生β晶型轉(zhuǎn)變的特性,使其在水溶液中的溶解性能發(fā)生改變,由可溶變?yōu)椴豢扇�。利用絲蛋白的這一特性,將絲蛋白作為SDF-1α的傳輸體系,固定SDF-1α于鉑金微彈簧圈表面,通過絲蛋白溶解性能的改變,實(shí)現(xiàn)緩釋SDF-1α的目的。綜上所述,利用具有良好生物相容性、可吸收的絲蛋白涂覆鉑金微彈簧圈,實(shí)現(xiàn)SDF-1α的有效負(fù)載,使其在動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)后隨著絲蛋白的吸收而實(shí)現(xiàn)SDF-1α的控釋、緩釋,其通過SDF-1特異性受體CXCR4能夠促進(jìn)EPCs遷移、歸巢,促進(jìn)動(dòng)脈瘤內(nèi)皮增殖、瘤腔纖維化以及瘤頸部位的內(nèi)皮覆蓋,從而降低動(dòng)脈瘤栓塞后復(fù)發(fā)率,利于動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)后達(dá)到解剖學(xué)愈合,減少復(fù)發(fā)和再次破裂出血風(fēng)險(xiǎn)。第一部分構(gòu)建負(fù)載SDF-1α的生物活性彈簧圈,及其結(jié)構(gòu)表征、性能檢測研究目的：構(gòu)建負(fù)載SDF-1α的新型生物活性彈簧圈,檢測彈簧圈的表面形貌及其緩慢釋放SDF-1α的性能,為研究負(fù)載SDF-1α彈簧圈趨化EPCs從而促進(jìn)動(dòng)脈瘤頸愈合奠定基礎(chǔ)。研究方法：將切割長度約8mm的彈簧圈超純水清洗過后用油泵抽干備用。將10μg的SDF-1α溶解于5001μ1的3%(m/v)的絲蛋白溶液中；將干燥好的彈簧圈浸泡于上述溶液中,制備負(fù)載SDF-la彈簧圈。使用掃描電子顯微鏡(SEM)檢測處理前彈簧圈及處理后彈簧圈的表面形貌,利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測負(fù)載SDF-la彈簧圈的緩釋性能。研究結(jié)果：SEM結(jié)果顯示處理后彈簧圈表面均勻涂覆聚合物,與處理器彈簧圈比較,形態(tài)無明顯改變。負(fù)載SDF-la彈簧圈的體外SDF-la釋放量在測試周期內(nèi)呈現(xiàn)明顯的積累遞增趨勢。研究結(jié)論：實(shí)現(xiàn)了SF/SDF-1α在彈簧圈表面的均勻涂覆和SDF-la體外釋放可控,成功制備負(fù)載SDF-la的生物活性彈簧圈。第二部分EPCs的分選、培養(yǎng)、鑒定及負(fù)載SDF-1α彈簧圈促進(jìn)EPCs的遷移研究目的：從大鼠骨髓中原代分離、培養(yǎng)和鑒定EPCs,為研究涂層彈簧圈對EPCs趨化影響動(dòng)脈瘤頸的愈合奠定基礎(chǔ),并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證涂層彈簧圈有促進(jìn)EPCs遷移的作用。研究方法：獲取重量為100g左右的雄性SD大鼠骨髓,使用Ficoll-PaqueTM淋巴細(xì)胞分離液收集分離的單個(gè)核細(xì)胞,使用EGM-2MV內(nèi)皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化EPCs,并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；利用流式細(xì)胞儀檢測CD133、CD34、 VEGFR-2的陽性表達(dá)率,利用體外毛細(xì)血管管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)檢測EPCs的管腔形成能力,利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察負(fù)載SDF-1α彈簧圈對EPCs遷移的影響。研究結(jié)果：培養(yǎng)24～48h后,單個(gè)核細(xì)胞開始出現(xiàn)貼壁,3～7d后呈現(xiàn)典型梭形細(xì)胞形態(tài),在細(xì)胞培養(yǎng)至7～14d時(shí),逐漸出現(xiàn)"Cord-like structures"及"Network formation"結(jié)構(gòu),而在細(xì)胞培養(yǎng)至28d時(shí),呈典型鋪路石樣改變。流式細(xì)胞儀分析提示細(xì)胞表面標(biāo)志CD133、CD34以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(VEGFR-2)分別為：66.38%、88.87%、82.69%。體外毛細(xì)血管管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示,EPCs有較強(qiáng)的管腔形成能力。Transwell遷移試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,與空白組相比,負(fù)載SDF-la彈簧圈可以有效促進(jìn)EPCs的遷移。研究結(jié)論：通過密度梯度離心法從骨髓分離單個(gè)核細(xì)胞,再用含VEGF、bFGF等因子EGM-2MV內(nèi)皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),利用體外毛細(xì)血管管腔形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀以VEGFR-2、CD133及CD34為標(biāo)志物對純化細(xì)胞進(jìn)行檢測,可獲得較為純化的EPCs,體外Transwell遷移試驗(yàn)顯示負(fù)載SDF-la彈簧圈對EPCs遷移有促進(jìn)作用。第三部分負(fù)載SDF-1α彈簧圈趨化移植EPCs促進(jìn)大鼠動(dòng)脈瘤腔纖維化及瘤頸的內(nèi)皮覆蓋研究目的：建立大鼠動(dòng)脈瘤模型,追蹤移植細(xì)胞與負(fù)載SDF-la彈簧圈關(guān)系,驗(yàn)證負(fù)載SDF-la彈簧圈對大鼠動(dòng)脈瘤的修復(fù)作用及動(dòng)脈瘤頸愈合作用。研究方法：60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為單純手術(shù)組、裸圈栓塞組、裸圈栓塞+EPCs移植組、負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞組、負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞+EPCs移植組。根據(jù)分組在右側(cè)頸總動(dòng)脈分別植入不同類型彈簧圈,并在術(shù)后通過尾靜脈注入EPCs細(xì)胞懸液。根據(jù)分組分別在術(shù)后14d、28d對大鼠麻醉,并灌注固定,取動(dòng)脈瘤部位血管組織,利用普通光學(xué)顯微鏡觀察動(dòng)脈瘤頸部位大體形態(tài)；應(yīng)用HE染色、Van Geson染色和Verhoeff's染色、免疫熒光染色對動(dòng)脈瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢測；利用熒光顯微鏡技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的EPCs在彈簧圈附著情況；利用掃描電鏡檢測彈簧圈標(biāo)本表面細(xì)胞貼附情況。研究結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞+EPCs移植組的動(dòng)脈瘤頸為新生內(nèi)膜所覆蓋,動(dòng)脈瘤頸部分愈合,內(nèi)膜表面粗糙14、28d時(shí)負(fù)載SDF-la彈簧圈聯(lián)合EPCs移植組的動(dòng)脈瘤頸愈合情況明顯優(yōu)于其他分組(P0.05)。掃描電鏡下檢測結(jié)果顯示14d時(shí)負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞HEPCs移植組的彈簧圈標(biāo)本表面的細(xì)胞數(shù)量明顯多于單純負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞組和其他組；28d時(shí)負(fù)載SDF-lα彈簧圈栓塞+EPCs移植組及單純負(fù)載SDF-1α彈簧圈栓塞組的彈簧圈標(biāo)本表面可見纖維膜覆蓋彈簧圈,其他三組僅有少量細(xì)胞團(tuán)覆蓋。HE染色、VanGeson染色和Verhoeff's染色、免疫熒光染色對動(dòng)脈瘤組織進(jìn)行病理檢查提示負(fù)載SDF-la彈簧圈栓塞+EPCs移植能夠促進(jìn)動(dòng)脈瘤壁內(nèi)皮增殖和瘤腔纖維化,可更好地達(dá)到閉塞動(dòng)脈瘤腔的目的。研究結(jié)論：負(fù)載SDF-1α彈簧圈在體內(nèi)能夠有效趨化EPCs,促進(jìn)動(dòng)脈瘤內(nèi)皮增殖、瘤腔纖維化,促進(jìn)動(dòng)脈瘤頸的內(nèi)皮覆蓋,為促進(jìn)動(dòng)脈瘤愈合、降低動(dòng)脈瘤復(fù)發(fā)率提供了一種新的思路和方法。
【關(guān)鍵詞】：顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α 內(nèi)皮祖細(xì)胞 絲蛋白 復(fù)發(fā) 內(nèi)皮化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-28
• 參考文獻(xiàn)24-28
• 第一部分 構(gòu)建負(fù)載SDF-1α的生物活性彈簧圈,及其結(jié)構(gòu)表征、性能檢測28-39
• 一、引言28-29
• 二、實(shí)驗(yàn)材料和方法29-33
• 三、結(jié)果33-35
• 四、討論35-37
• 小結(jié)37
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 第二部分 EPCs的分選、培養(yǎng)、鑒定及負(fù)載SDF-1α彈簧圈促進(jìn)EPCs的遷移39-53
• 一、引言39-40
• 二、實(shí)驗(yàn)材料和方法40-46
• 三、結(jié)果46-48
• 四、討論48-50
• 小結(jié)50
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 第三部分 負(fù)載SDF-1α彈簧圈趨化移植EPCs促進(jìn)大鼠動(dòng)脈瘤腔纖維化及瘤頸的內(nèi)皮覆蓋53-78
• 一、引言53-56
• 二、實(shí)驗(yàn)材料和方法56-66
• 三、結(jié)果66-68
• 四、附圖68-71
• 五、討論71-74
• 小結(jié)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-78
• 全文總結(jié)78-79
• 中英文縮略詞對照表79-81
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文81-82
• 致謝82-84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 汪求精;孫新林;姬斌;祝愛萍;全大萍;;負(fù)載VEGF聚合物修飾鉑金微彈簧圈的實(shí)驗(yàn)研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2009年11期

2 陳濤;錢萬強(qiáng);;國內(nèi)外干細(xì)胞研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展態(tài)勢分析[J];中國科技論壇;2011年10期

  本文關(guān)鍵詞：絲蛋白涂層彈簧圈可控釋放SDF-1α及其誘導(dǎo)EPCs參與大鼠動(dòng)脈瘤修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：359684