本文關(guān)鍵詞：氫氣微泡減輕心肌缺血再灌注損傷的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景隨著生活水平的提高及工作習(xí)慣的改變,急性心肌梗塞的發(fā)病率逐年上升。如何治療急性心梗、降低其死亡率成為一個(gè)世界性的難題。由于該病的長(zhǎng)期和短期發(fā)病率及致死率與心肌梗死的面積直接相關(guān),所以如何及時(shí)恢復(fù)缺血心肌的血流灌注、減少心梗的面積,成為急性心梗的重要治療方向之一。直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)作為一種快速恢復(fù)心肌血管灌注的方法,成功挽救無(wú)數(shù)急性心�；颊叩纳Ｈ欢藗儼l(fā)現(xiàn),在缺血心肌恢復(fù)血流的過(guò)程中,血流再灌注本身會(huì)對(duì)心肌造成進(jìn)一步的損傷,增大心梗面積。此現(xiàn)象即為缺血再灌注損傷。再灌注損傷嚴(yán)重影響心梗患者的預(yù)后。因此,在恢復(fù)冠脈血流的同時(shí)減少再灌注損傷,成為治療心肌梗死的首選方法。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,主要包括活性氧學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、鈣超載學(xué)說(shuō)和能量障礙學(xué)說(shuō)等,但前三種學(xué)說(shuō)是目前比較公認(rèn)的心肌缺血再灌注損傷的主要發(fā)生機(jī)制。心肌缺血再灌注損傷的治療方法有很多,主要包括藥物治療、物理治療和基因治療。藥物治療是目前心肌缺血再灌注損傷臨床應(yīng)用和研究較多的治療方法,包括化學(xué)藥(如他汀類藥物、腎素-血管緊張素系統(tǒng)類、糖皮質(zhì)激素類等)、中藥(如黃連素、冠心寧、苦碟子等)、多肽藥物(如腦利鈉肽)等。這些藥物具有一定的保護(hù)心肌作用,但療效不甚顯著。物理治療主要包括缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后處理、遠(yuǎn)處缺血處理等。但因其機(jī)制不明,療效不確切,臨床應(yīng)用受到局限�；蛑委熓且环N新的治療模式,為心肌缺血再灌注損傷的治療開(kāi)辟了新的前景,但目前真正意義上的心肌缺血再灌注損傷的基因治療還未完全開(kāi)展,其最終的應(yīng)用價(jià)值仍值得深入探討。所以盡管防治心肌缺血再灌注損傷的方法很多,但療效并不理想,尋找一種安全可靠、療效顯著的心肌缺血再灌注損傷的治療方法,仍是心血管疾病研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題之一。氣體治療是近年來(lái)新興的一種治療缺血再灌注損傷的新方法,其主要原理為減少活性氧的產(chǎn)生或抑制炎癥反應(yīng)。用于氣體治療的氣體主要有NO、CO、 H2S等。但這些氣體對(duì)人體具有一定的毒性,其應(yīng)用受到限制。氫氣作為一種無(wú)毒的還原性氣體,其在缺血再灌注損傷中的抗氧化作用逐漸被人們發(fā)現(xiàn)�？谇爸委熑毖俟嘧p傷的主要供氫氣方式為直接吸入法和飲用或注射氫氣鹽水法,但由于氫氣的易燃易爆和極易擴(kuò)散的特性,這些供氫氣方法一面存在安全隱患,一方面制作、運(yùn)輸、保存較困難,成本較高,另一方面到達(dá)心肌的氫氣有效劑量較低,往往難以達(dá)到療效。脂質(zhì)微泡是一種由脂質(zhì)外殼包裹惰性氣體而成的一種聲學(xué)造影劑,已廣泛的應(yīng)用于臨床。其脂質(zhì)外殼較致密,能夠包裹氫氣并抑制其擴(kuò)散。同時(shí),脂質(zhì)微泡粒徑多在微米級(jí),不能自由穿過(guò)血管壁,能夠防止氫氣在到達(dá)心肌組織前擴(kuò)散至其他組織間隙。由此,我們提出：擬用脂質(zhì)包裹氫氣以制作一種載氫氣的脂質(zhì)微泡,用于心肌缺血再灌注損傷的治療,以探索一種簡(jiǎn)單安全的氫氣治療的新方法。目的1.探索脂質(zhì)微泡搭載氫氣以制作氫氣微泡的可行性；2.探索氫氣微泡治療心肌缺血再灌注損傷的可能性及其機(jī)制。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：制作脂質(zhì)微泡的磷脂材料DSPC、DSPE-PEG2000購(gòu)自美國(guó)Avanti公司,安全無(wú)菌,組織相容性好。全氟丙烷氣體購(gòu)自天津核工業(yè)理化工程研究院；氫氣購(gòu)自深圳市深特工業(yè)氣體有限公司,純度達(dá)99%以上；氫氣微電極系統(tǒng)購(gòu)自丹麥Unisense公司,此系統(tǒng)由化學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)處理系統(tǒng)和微操作系統(tǒng)三部分組成。化學(xué)系統(tǒng)即是氫氣微電極,信號(hào)處理系統(tǒng)包括信號(hào)交換器和皮安表。其工作原理為氫氣經(jīng)擴(kuò)散作用經(jīng)過(guò)氫氣微電極的硅膜后,在傳感器的鉑陽(yáng)極處氧化產(chǎn)生電子流。在傳感器電子流從氧化的陽(yáng)極流向內(nèi)部的參比,同時(shí)皮安表獲得線性的氫氣分壓信號(hào)。此系統(tǒng)在水中檢測(cè)氫氣的極限濃度為0.3μM; VEVO2100小動(dòng)物超聲成像儀購(gòu)自VisualSonics公司,應(yīng)用與其配套的MS-250超聲探頭(中心頻率21MHz,寬帶頻率13MHz～24 MHz,分辨率達(dá)到75微米,實(shí)時(shí)幀頻大于500fps),在M-MODE模式下測(cè)量大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD雄性大鼠購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重250～300克,飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。2.實(shí)驗(yàn)方法2.1氫氣微泡的制備與表征DSPC,DSPE-PEG2000以摩爾比9：1,利用薄膜震蕩法制作氟氫比(C3F8/H2)為3：0、1：1和0：3的脂質(zhì)微泡。測(cè)量比較不同微泡的粒徑、濃度和含氫量,并在顯微鏡下觀察微泡的形態(tài)。挑選出含氫量高、粒徑和濃度均適宜的微泡做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用氫氣微電極系統(tǒng)檢測(cè)氫氣微泡在體外PBS溶液中和大鼠左心室腔內(nèi)隨時(shí)間的釋氫曲線。將濃度為5×105、5×106、5×107、5×108、5×109/ml的氫氣微泡裝入橡膠袋中,應(yīng)用VEVO2100超聲成像儀對(duì)其進(jìn)行超聲成像,并測(cè)量每種微泡的視屏強(qiáng)度信號(hào)。將2×1010個(gè)氫氣微泡經(jīng)尾靜脈注入大鼠體內(nèi),應(yīng)用VEVO 2100超聲成像儀檢測(cè)左心室造影成像的效果,并繪制時(shí)間-視頻強(qiáng)度曲線。2.2動(dòng)物模型的制備及分組取成年雄性SD大鼠麻醉后切斷左側(cè)第3或第4根肋骨,暴露心臟結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈形成心肌缺血,30分鐘后松開(kāi)結(jié)扎線形成再灌注。所有大鼠隨機(jī)分為三組：①假手術(shù)組,只進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù),不進(jìn)行缺血操作；②普通微泡組,再灌注前5分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量未載氫氣的普通微泡；⑧氫氣微泡組,再灌注前分鐘經(jīng)尾靜脈注入一定量氯氣微泡。為研究心肌梗死面積與氫氣微泡劑量的關(guān)系,在②、③組中另設(shè)高劑量組和低劑量組。高劑量,每只大鼠注入2×1010個(gè)微泡；低劑量,每只大鼠注入4×109個(gè)微泡。2.3缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測(cè)量再灌注24小時(shí)后開(kāi)胸拉緊結(jié)扎線形成與之前相同的心肌缺血,經(jīng)尾靜脈注入伊文思藍(lán)染液以區(qū)分缺血區(qū)與非缺血區(qū)。迅速處死大鼠后取心臟沿短軸位做切片,進(jìn)行TTC染色,以區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)。測(cè)量梗死區(qū)的面積(INF)、缺血區(qū)面積(AAR)和左心室的面積(LV),并計(jì)算AAR/LV、INF/AAR及INF/LV。2.4超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠心肌功能再灌注24小時(shí)后,用VEVO 2100小動(dòng)物超聲成像儀測(cè)量各組大鼠的左室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短分?jǐn)?shù),以評(píng)價(jià)各組大鼠的心功能。2.5 HE染色觀察各組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)變化再灌注24小時(shí)后,取大鼠心臟做石蠟切片,進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察各組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)。2.6 TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡再灌注24小時(shí)后,取大鼠心臟做石蠟切片,利用TUNEL法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。2.7炎性因子TNF-α,IL-1β的檢測(cè)再灌注24小時(shí)后,取大鼠心臟作組織勻漿,ELISA法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α, IL-1β的含量。2.8活性氧H2O2、NO·、·OH及O2-·的檢測(cè)再灌注40分鐘后,取大鼠心臟作組織勻漿,迅速與CM-H2DCFDA、DAF-2DA、HPF及MitoSOX指示劑反應(yīng),酶標(biāo)儀測(cè)定各自的熒光強(qiáng)度以計(jì)算各自的濃度。2.9毒性實(shí)驗(yàn)取健康SD大鼠3只,注射氫氣微泡前經(jīng)尾靜脈抽取大鼠血液100μl,注射氫氣微泡后第3、7天再分別取血液100μl。用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)大鼠血液樣品進(jìn)行分析。第7天取完血液后,離頸處死并取大鼠的心、肝、脾、肺、腎做石蠟切片,行HE染色,觀察其結(jié)構(gòu)改變。并用3只未注射氫氣微泡的健康大鼠作對(duì)照。2.10統(tǒng)計(jì)方法所有結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,心肌梗死面積、左心室功能的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),心肌細(xì)胞凋亡、炎癥因子、活性氧的比較采用One-way ANOVA分析,組間多重比較用Bonferroni法。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS13.0軟件,并以P0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1.成功制得不同C3F8/H2的氫氣微泡,其中C3F8/H2為1：1的氫氣微泡的含氫量最高,達(dá)(1.46±0.08)μmol/ml,微泡的平均粒徑為(0.89±0.03)μm,濃度為(2.29±0.07)×1010/ml。光鏡下微泡呈中心透亮的球形,大小較均勻。2.氫氣微泡在體外PBS溶液及體內(nèi)左心室腔內(nèi)均能自發(fā)釋放氫氣。3.氫氣微泡在體外、體內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)超聲增強(qiáng)造影成像。4.與普通微泡組相比,氫氣微泡組大鼠心肌梗死面積顯著減小(P0.05)。高劑量的氫氣微泡與低劑量相比,其心肌梗死面積更小(P0.01),對(duì)心肌的保護(hù)作用更顯著。5.與普通微泡組相比,氫氣微泡組的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減小,顯微鏡下氫氣微泡組大鼠的心肌結(jié)構(gòu)明顯好于普通微泡組。同時(shí),氫氣微泡組EF、FS均明顯高于普通微泡組(P0.05),說(shuō)明氫氣微泡能保護(hù)缺血再灌注損傷后的心肌功能。6.與普通微泡組相比,氫氣微泡組大鼠心肌組織中炎性因子TNF-α、IL-1β的含量明顯減低,說(shuō)明氫氣微泡能顯著緩解心肌的炎癥反應(yīng)。7.與普通微泡組相比,氫氣微泡組大鼠心肌組織中·OH含量顯著降低,而H2O2、NO·及O2-·含量未見(jiàn)明顯差異。8.注射氫氣微泡前及注射后3、7天大鼠的血常規(guī)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均在正常值范圍內(nèi)。大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要內(nèi)臟器官組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常改變。結(jié)論1.脂質(zhì)微泡可以包裹氫氣,是一種理想的氫氣載體。2.氫氣微泡可顯著減少心肌缺血再灌注后心肌的梗死面積,抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌結(jié)構(gòu),并且改善心肌收縮功能；3.氫氣微泡可以抑制缺血再灌注后心肌的炎性反應(yīng),抑制·OH的生成,減少心肌損傷；4.氫氣微泡的生物相容性好,對(duì)大鼠無(wú)毒性。上述結(jié)果表明氫氣微泡在心肌缺血再灌注損傷中可以起到保護(hù)心肌的作用,這為臨床治療缺血再灌注損傷提供了一種新方法。同時(shí)也為超聲成像引導(dǎo)下的可視化氣體治療提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：氫氣微泡 心肌缺血再灌注 凋亡 炎性反應(yīng) 活性氧
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-29
• 一、材料與方法29-38
• 1.實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2.實(shí)驗(yàn)方法31-38
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-52
• 1.利用薄膜振蕩法成功制得不同氟氫比的脂質(zhì)微泡38-40
• 2.氫氣微泡在體外及體內(nèi)均可自發(fā)釋放出氫氣40-41
• 3.氧氣微泡可以實(shí)現(xiàn)超聲造影成像41-42
• 4.氫氣微泡可減少心肌缺血再灌注損傷后心肌的梗死面積42-45
• 5.氫氣微泡可保護(hù)缺血再灌注損傷后的左心室功能45-46
• 6.氫氣微泡可明顯降低缺血再灌注損傷對(duì)大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響46
• 7.氫氣微泡能選擇性降低心肌缺血再灌注損傷后也肌組織中-OH的水平46-48
• 8.氫氣微泡可減少心肌缺血再灌注損傷后TNF-a、II-Iβ的生成48
• 9.氫氣微泡可減少缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的調(diào)亡48-50
• 10.氫氣微泡對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)及主要臟器的結(jié)構(gòu)無(wú)影響50-52
• 三、討論52-58
• 全文總結(jié)58-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• 縮略語(yǔ)表69-71
• 碩士研究生期間發(fā)表的文章71-72
• 致謝72-74

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 童光;HO-1介導(dǎo)心肌細(xì)胞κ-阿片受體激活的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 崔賀賀;通心絡(luò)對(duì)心臟微血管內(nèi)皮缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉麗君;戊二醛聚合豬血紅蛋白對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[D];西北大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：氫氣微泡減輕心肌缺血再灌注損傷的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：331250