本文關(guān)鍵詞：細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡與外燥傷肺病機的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：肺吸入自然界之清氣且散納有度,氣道潔凈則貴在流通宣暢。與現(xiàn)代醫(yī)學中的小血管、微血管包括微循環(huán)高度相關(guān)的豐富肺絡(luò)脈是“肺司呼吸”功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。氣體與肺毛細血管血液之間進行氣體交換所通過的六層厚約0.2 μm-1μm的組織結(jié)構(gòu)稱為呼吸膜(respiratory membrane, RM),其擴散速率與RM厚度呈反比。精細的解剖學知識與生理學機制將為呼吸膜與“肺司呼吸”理論在微觀結(jié)構(gòu)層次、體內(nèi)外氣體交換功能和多以喘咳主癥的相似性提供生理、生化、病理等客觀標準與參照系,成為溝通人類證候與模型動物證候的橋梁。外燥傷肺的病機實質(zhì)涉及外邪與機體微觀物質(zhì)如促炎細胞因子／抗炎細胞因子、水液代謝相關(guān)基因表達的平衡紊亂。查新資料顯示近20年未見相同研究報道。本學位論文課題以《內(nèi)經(jīng)》六淫外燥傷肺理論為指導,以前期相關(guān)研究為基礎(chǔ),結(jié)合微超病理學、免疫學、分子生物學理論與技術(shù),以氣道細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡為切入點,研究促炎細胞因子／抗炎細胞因子平衡失調(diào)、AQP5基因表達異常,證實“氣道細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡導致肺部炎性病理改變是傷肺喘咳證候物質(zhì)基礎(chǔ)”的假說,根據(jù)研究結(jié)果闡析氣道細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡導致外燥傷肺喘咳病機的物質(zhì)基礎(chǔ)及病理生理學機制,為推進六淫傷肺喘咳共性物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實驗依據(jù),具有理論創(chuàng)新與臨床指導意義。材料：一、實驗動物：昆明種小鼠(SPF級,體重17±1g)132只,雌雄各半(湖北省實驗動物中心提供,實驗動物許可證號：鄂準字2008-2005)。小鼠經(jīng)數(shù)字法隨機分常溫常濕組、溫燥組、涼燥組,每組44只。二、主要儀器：LRH-250人工智能氣候箱,溫度(6-65℃)±1℃,相對濕度(30%-90%)±3%(廣東醫(yī)療器械廠),MASTER-K30H風扇程控儀(韓國Best機電有限公司),HITACHI-7500透射電鏡(日本),BioTek酶標儀(美國),熒光定量PCR系統(tǒng)(SLAN, HONGSHI,美國),掃描儀(V300, EPSON),徠卡普通與超薄切片機(德國),neofuge 15R冷凍離心機(heal force,中國香港),DYY-6c電泳儀(北京六一儀器廠),紫外分光光度計(752-P,上�，F(xiàn)科儀器有限公司)。三、主要試劑：NE(批號201310)、al-AT (201310)、ET (20038)、PAF (20204)單克隆抗體試劑盒(IBL-America公司);IL-10(1201267)與TNF-a (1201262)單克隆抗體試劑盒(美國RD公司)。兔抗小鼠AQP5多克隆抗體試劑盒(DA0648,200902,武漢博士德生物技術(shù)有限公司),生物素化羊抗兔二抗、SABC試劑盒、DAB、L-多聚賴氨酸及陽性對照片均購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSK-100)與SYBR Green realtime PCR master mix-plus (QPK212 plus, TOYOBO公司)；抗體Actin (Sc-1616r)為美國pierce公司)；乙醚、甲醛(20090325,上海)、PBS均為分析純。方法：132只昆明種小鼠經(jīng)數(shù)字法隨機分為常溫常濕組、溫燥組和涼燥組,每組44只,分批置人工氣候箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng),按文獻綜合條件刺激造模。各組小鼠在第6天、第12天檢測以下項目；小鼠剖檢前4h常規(guī)禁食、禁水。檢測項目：一、肺組織病理學觀察1.普通病理學觀察：斷頸處死小鼠,取小鼠右肺組織(中)40±1Omg/只,常規(guī)石臘切片、HE染色與光鏡觀察。2.超微結(jié)構(gòu)觀察：各組隨機取4只小鼠經(jīng)乙醚麻醉,經(jīng)氣管插管向肺內(nèi)注入2%戊二醛1.0 ml固定1h后,取左肺中葉組織制成1cm × 1cm × 2cm組織塊,常規(guī)切片、醋酸鈾染色與透射電鏡拍片；觀察肺呼吸膜、肺間質(zhì)超微結(jié)構(gòu),用JEDA 80ID圖像軟件(江蘇捷達公司)分析呼吸膜平均厚度。二、促炎細胞因子/抗炎細胞因子水平檢測各組經(jīng)常規(guī)氣管插管法取支氣管肺灌洗液1.5 ml、置-82℃保存、7天內(nèi)統(tǒng)一檢測。用單克隆抗體ELISA試劑盒,按說明書操作,設(shè)空白對照、PBS陰性對照；BioTek酶免疫分析儀495 nm測定OD值,查標準品曲線計算待檢標本含量。三、分子生物學檢測(一)肺組織水通道蛋白5mRNA測定采用熒光實時PCR方法檢測。檢索NCBI(美國國家生物信息中心)查詢基因序列,0ligo6軟件設(shè)計擴增模板引物(上海生工生物技術(shù)公司),上游引物：5'-GGCTGCAATCCTCTACTTCTAC-3',下游引物：5'-TTCTTCCGCTCCTCTCTATGA-3'(127bp)；內(nèi)參照基因β-肌動蛋白(β-actin)引物序列：上游引物：5'-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3',下游引物：5'-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3'(191bp)。 RT-PCR反應體系為50u1：目的cDNA4u1、Taq DNA聚合物2ul (1u/1ul)、12.5pmol的引物a、b各2ul、4×10nM dNTP 2u1;經(jīng)95℃預變性、55℃退火、72℃延伸等40個循環(huán)。采用2-△△Ct方法計算AQP5 mRNA表達水平。(二)肺組織水通道蛋白5蛋白質(zhì)表達水平檢測常規(guī)Western blotting方法檢測。主要操作步驟：提取總蛋白、BCA(bicinchoninic acid)法測定上清液中蛋白質(zhì)含量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應、化學發(fā)光,顯影,定影、膠片掃描,alphaEaseFc圖像分析軟件進行密度分析并計算灰度值,所得結(jié)果為目的蛋白的相對含量。四、統(tǒng)計學方法：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,顯著性檢驗采用多個樣本均數(shù)間q檢驗(Newman-Keuls法)：P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,檢驗水準為雙側(cè)a=0.05。結(jié)果：一、組織病理學觀察(一)普通組織病理學觀察再次顯示,與常溫常濕組第6、第12天肺組織結(jié)構(gòu)無異常比較,溫燥組、涼燥組肺泡片狀瘀血、水腫與纖維素性滲出物,肺間質(zhì)增厚與炎性細胞侵潤,伴肺氣腫現(xiàn)象,均以第12天為重。(二)超微結(jié)構(gòu)觀察1、常溫常濕組第6、第12天肺呼吸膜清晰,毛細血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)清晰；Ⅱ型肺泡細胞(AT ⅡI)與Ⅰ型肺泡細胞(AT Ⅰ)連接清晰,AT Ⅱ微絨毛豐富且規(guī)則排列于胞膜肺泡緣處；胞內(nèi)嗜鋨性板層小體(OMB)較多且分泌旺盛；線粒體數(shù)量豐富。溫燥組、涼燥組AT ⅡI微絨毛減少,胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少,并多見腫脹為“條狀面包狀”線粒體；肺泡隔部增寬、呼吸膜增厚、毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹。2、常溫常濕組第6天、第12天肺泡隔、AT Ⅰ與AT Ⅱ結(jié)構(gòu)清晰,肺泡毛細血管與呼吸膜結(jié)構(gòu)無異常,毛細血管結(jié)構(gòu)清晰無腫脹；溫燥組、涼燥組肺泡隔增寬伴膠原纖維增生,肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹,AT Ⅰ基膜腫脹、多不規(guī)則且多見點狀斷裂,AT Ⅰ基膜與毛細血管基膜組織間隙明顯增寬。圖像分析溫燥組、涼燥組呼吸膜較常溫常濕組明顯增厚(p0.05)。二、氣管肺泡灌洗液中促炎細胞因子/抗炎細胞因子水平1.與常溫常濕組NE與al-AT比較,溫燥組與涼燥組第6、第12天NE升高,以涼燥組為重(p0.05)；兩組al-AT下降,也以涼燥組為甚(p0.05)。2.常溫常濕組TNF-a與IL-10,溫燥組第12天、涼燥組第6與第12天TNF-a下降但無統(tǒng)計學意義；溫燥組、涼燥組第6、第12天IL-10含量下降(p0.01)。3.與常溫常濕組ET與PAF比較,溫燥組第6、第12天ET升高但無統(tǒng)計學意義,涼燥組則變化不明顯。溫燥組、涼燥組第6、第12天PAF升高(p0.05)。三、AQP5 mRNA與蛋白質(zhì)表達水平測定與常溫常濕組比較,溫燥組、涼燥組第6、第12天AQP5 m RNA表達下調(diào)(p0.01),以第12天為重(p0.01)；溫燥組第6、第12天AQP5蛋白質(zhì)表達水平持續(xù)下降,涼燥組則是先升后降(p0.01)。討論：1.超微結(jié)構(gòu)顯示外燥損傷呼吸膜的病理特征是：AT Ⅰ基膜腫脹且不規(guī)則、毛細血管基底膜增厚與內(nèi)皮細胞腫脹且部分呈剝脫狀性呼吸膜增厚。首次圖像量化分析顯示溫燥組、涼燥組呼吸膜較常溫常濕組顯著增厚(p0.05)。結(jié)合文獻報道的外燥致AT Ⅱ線粒體腫脹表明AT Ⅱ能量代謝障礙、嗜鋨板層小體減少提示ATⅡ合成肺表面活性物質(zhì)的功能受損,而外燥致肺泡內(nèi)壁水分子層的減少可影響表面活性物質(zhì)在其上形成穩(wěn)定的單分子磷脂層膜而致肺失濡養(yǎng),必失有效調(diào)節(jié)肺泡表面張力之功并致肺泡通氣功能障礙,提出呼吸膜增厚是外燥傷肺的特征性超微組織病理學基礎(chǔ)和超微病理學指標。2.外燥引起AT Ⅱ合成與分泌肺泡表面活性物質(zhì)減少,導致肺失濡潤性肺泡超微結(jié)構(gòu)受損后的某些成分作為“內(nèi)源性危險信號”(Damage associated molecular patern, DAMP)激活單核／巨噬細胞肺內(nèi)聚集并大量釋放促炎細胞因子,導致促炎細胞因子／抗炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡紊亂,啟動以中性粒細胞釋放蛋白酶和血小板活化因子為中心的失控性細胞因子級聯(lián)反應,是外燥傷肺病機的分子生物學基礎(chǔ)。3.促炎／抗炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡引起AQP5基因表達下調(diào)及蛋白質(zhì)水平下降提示肺泡液轉(zhuǎn)運障礙；失控性炎癥反應引起炎性介質(zhì)瘀滯、肺毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、血管通透性增高與液體滲出導致基膜組織間隙水腫性呼吸膜增厚,重則肺泡瘀血、水腫,導致O2和CO2的擴散速率和有效通氣／血液比值下降而損“肺通天氣”之功,成為解析外燥傷肺、氣逆、喘咳諸癥的病理生理學基礎(chǔ)。4.結(jié)果顯示外燥傷肺不同于“以TNF-a為主的炎性細胞因子‘瀑布效應’損傷肺絡(luò)而致喘咳諸癥的病理學基礎(chǔ)”的報道,表明與外燥病邪致病特征相關(guān)。學位課題研究的創(chuàng)新點：1、首次提出Ⅰ型肺泡上皮細胞基膜腫脹、肺毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹與血管通透性增高及液體滲出導致基膜組織間隙水腫性呼吸膜增厚,是外燥傷肺的特征性超微組織病理學基礎(chǔ)。2、首次提出以肺毛細血管為中心拍攝呼吸膜薄側(cè)以量化測定呼吸膜平均厚度的方法。3、首次提出外燥引起AT Ⅱ合成與分泌肺泡表面活性物質(zhì)減少,導致肺失濡潤與肺泡超微結(jié)構(gòu)受損后的某些成分作為“內(nèi)源性危險信號”大量激活單核／巨噬細胞,引起促炎／抗炎細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡,且下調(diào)肺水通道蛋白5基因表達與蛋白質(zhì)水平,啟動以中性粒細胞彈性蛋白酶和血小板活化因子為中心的失控性炎性細胞因子級聯(lián)反應,通過肺泡水液轉(zhuǎn)運失調(diào)、肺毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹、基膜組織間隙水腫等導致呼吸膜增厚而損“肺通天氣”之功。提出促炎／抗炎細胞因子失衡與AQP5基因表達紊亂可作為解析外燥傷肺病機的分子病理生理學基礎(chǔ)和特征性指標之一；豐富了外燥傷肺理論,具有理論創(chuàng)新與臨床指導意義。
【關(guān)鍵詞】：外燥 呼吸膜 細胞因子 水通道蛋白5基因
【學位授予單位】：長江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R254.4
【目錄】：

• 摘要4-9
• abstract9-16
• 縮寫詞表16-19
• 第1章 燥邪基礎(chǔ)理論探析19-25
• 1.1 外燥病變特點與臨床辨治19
• 1.2 細胞因子與呼吸膜損傷的相關(guān)研究概況19-23
• 1.3 水通道蛋白表達異常與肺部損傷23
• 1.4 相關(guān)研究的啟示與提出科研假說23-24
• 1.5 研究的主要內(nèi)容與意義24-25
• 第2章 外燥小鼠呼吸膜超微結(jié)構(gòu)觀察25-29
• 2.1 主要材料25
• 2.2 方法25-27
• 2.3 結(jié)果27-29
• 第3章 外燥對小鼠氣道液細胞因子的影響29-33
• 3.1 主要材料29
• 3.2 方法29-30
• 3.3 結(jié)果30-33
• 第4章 外燥對肺組AQP5基因與蛋白質(zhì)表達的影響33-38
• 4.1 主要材料33
• 4.2 方法33-37
• 4.3 結(jié)果37-38
• 第5章 討論38-45
• 5.1 呼吸膜厚度測定方法的研究38-39
• 5.2 外燥對呼吸膜超微結(jié)構(gòu)的影響與特征39-40
• 5.3 細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡與外燥傷肺病機的相關(guān)性及意義40-43
• 5.4 學位課題研究的創(chuàng)新點43-44
• 5.5 對繼續(xù)研究的建議44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻46-49
• 附一：呼吸膜與呼吸系統(tǒng)疾病研究進展49-56
• 個人簡介56-57
• 長江大學醫(yī)學倫理審查申請表57-58

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：細胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡與外燥傷肺病機的實驗研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：306476