本文關(guān)鍵詞：頭部淺低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷及mTOR通路的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的四血管阻斷法制備全腦缺血再灌注的Wistar大鼠模型,全腦缺血前經(jīng)由側(cè)腦室注射m TOR(mammalian target of rapamycin)抑制劑雷帕霉素(Rapamycin,RPM)抑制其活性,并聯(lián)合使用鼻咽腔降溫法對頭部進(jìn)行淺低溫處理,處理完成后觀察再灌注時期大鼠腦內(nèi)P70s6K、p-P70S6K(磷酸化的P70s6K)的表達(dá)以及海馬CA1區(qū)m TOR、p-m TOR(磷酸化的m TOR)的表達(dá)。研究淺低溫在頭部的實(shí)施以及抑制m TOR通路的活性聯(lián)合淺低溫在頭部的實(shí)施對大鼠大腦缺血后再灌注損傷的影響,由此進(jìn)一步探討在頭部實(shí)施淺低溫對該損傷可能產(chǎn)生影響的機(jī)制,為臨床上預(yù)防或治療腦部缺血后再灌注損傷性疾病提供新的理論依據(jù)。方法:1實(shí)驗(yàn)分組體重250~300g的健康雄性清結(jié)級Wistar大鼠60只(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心供應(yīng))。將大鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究需要隨機(jī)分為5組(n=12):假手術(shù)組(S組)、全腦缺血/再灌注組(I組)、低溫組(T組)、低溫+Rapamycin組(R組)、低溫+DMSO組(D組)。2全腦缺血再灌注模型制備本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠常規(guī)禁食8小時,無需禁水,稱重后進(jìn)行麻醉,以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射。麻醉完成后將動物固定在動物實(shí)驗(yàn)臺上,俯臥位進(jìn)行剪毛、消毒,在頸后正中第一、二頸椎處切開皮膚并進(jìn)行組織分離,使雙側(cè)翼小孔暴露。使用自制實(shí)驗(yàn)器材的尖端深入雙側(cè)小孔中燒灼其下走行的兩側(cè)椎動脈造成閉塞,縫合皮膚并消毒。24 h后以同樣方法再次麻醉大鼠,麻醉成功后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺上,氣管插管維持自主呼吸,吸入氧氣以及間斷給予七氟醚維持麻醉。開放尾靜脈通路以1ml/h速度持續(xù)泵入乳酸鈉林格氏液以保證大鼠機(jī)體循環(huán)需要。頸前正中剪毛消毒切開皮膚,分離雙側(cè)頸總動脈,用4-0絲線分別穿過雙側(cè)頸總動脈備用。3實(shí)驗(yàn)處理與監(jiān)測室溫維持在23~25℃,用小熱水袋放置于大鼠軀干下并聯(lián)合調(diào)整60瓦白熾燈高度保證大鼠直腸溫度始終維持在(37.0±0.5)℃。大鼠全腦缺血時間為15 min,再灌注2 h。各實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同處理干預(yù):S組即假手術(shù)組暴露雙側(cè)翼小孔,分離雙側(cè)頸總動脈,但不燒灼椎動脈使其閉塞,也不夾閉雙側(cè)頸總動脈。剩余四組均燒灼雙側(cè)椎動脈并夾閉雙側(cè)頸總動脈,造成全腦缺血。其中,T、R、D組為低溫組,均實(shí)施低溫處理:在全腦缺血前對大鼠進(jìn)行氣管插管,在咽喉部氣管插管旁放置棉球及吸痰管以防止誤吸,經(jīng)雙側(cè)鼻腔置入20G硅膠管,深度約為20 mm,以100 ml·min-1·kg-1速度持續(xù)泵入4-5℃0.9%氯化鈉溶液對頭部實(shí)施淺低溫處理,低溫過程中使用吸引器持續(xù)吸引防止誤吸。等到海馬溫度降至(33.0±0.5)℃后,將雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎15 min,低溫維持1 h后保持自然復(fù)溫。R、D組為給藥組,在全腦缺血前1h利用大鼠腦立體定位儀為R組經(jīng)左側(cè)腦室緩慢注射Rapamycin 5μl(10mmol/l),D組左側(cè)腦室注射等容量的DMSO。實(shí)驗(yàn)全程監(jiān)測大鼠腦電圖(頭皮刺入電極)、心電圖(四肢皮下刺入電極)、海馬溫度(溫度探頭置入右側(cè)海馬CA1區(qū)即前囟后3.6 mm、中線右旁開3 mm和皮層下2 mm)以及直腸溫度。4標(biāo)本采集及檢測4.1免疫組織化學(xué)法測定腦組織中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的表達(dá)及蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡檢測假手術(shù)組觀察2h,剩余四組再灌注2 h后,每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行麻醉(10%水合氯醛腹腔注射)麻醉成功后,用4%多聚甲醛迅速經(jīng)心灌流固定,固定后快速斷頭取腦并將腦組織放入4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定,在4℃冰箱中保存,標(biāo)本用于免疫組織化學(xué)檢測。4.2海馬Western Blot方法檢測m TOR、p-m TOR蛋白表達(dá)取每組另外6只大鼠,以10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉完成后,快速斷頭打開顱骨取出大腦,在冰盤上謹(jǐn)慎分離出海馬組織,快速放入冷凍管暫時保存在于液氮中,之后移入-80℃的冰箱中保存準(zhǔn)備用于Western Blot方法檢測m TOR、p-m TOR蛋白表達(dá)。結(jié)果:1五組大鼠的體重比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)2 HE染色后光鏡觀察病理結(jié)果S組:位于海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)均正常。細(xì)胞胞漿豐富呈粉紅色,細(xì)胞核大而圓呈藍(lán)色,核仁明顯,細(xì)胞整體呈圓形和橢圓形并且邊界清晰。細(xì)胞排列整齊且分布均勻,未見異常細(xì)胞。I組:海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷,正常細(xì)胞顯著減少,可見胞體皺縮,胞漿腫脹。細(xì)胞形狀不規(guī)則,排列紊亂且分布不均。存活細(xì)胞顯著減少。T組:與I組相比,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)的損傷程度明顯減輕。有少量細(xì)胞胞體皺縮,細(xì)胞排列稍顯紊亂,層次增多,存活細(xì)胞數(shù)目明顯增多。R組:與T組相比,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷較重,胞體皺縮變小,細(xì)胞核固縮深染,細(xì)胞形狀不規(guī)則,細(xì)胞排列不規(guī)整,存活細(xì)胞數(shù)目減少。D組:與R相比,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷程度較輕,細(xì)胞排列比較整齊,存活細(xì)胞數(shù)目明顯增多,與T組相比,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷無顯著差異。3腦組織中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的比較與S組比較,I組、T組、R組和D組p-P70S6K表達(dá)均增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與I組比較,T組、R組和D組p-P70S6K蛋白表達(dá)均增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與T組比較,R組p-P70S6K蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與D組比較,R組海馬組織中p-P70S6K蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組P70S6K蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。其余組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4大腦海馬CA1區(qū)m TOR蛋白及p-m TOR蛋白表達(dá)的比較與S組比較,I組、T組、R組和D組p-m TOR蛋白表達(dá)均增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與I組比較,T組、R組和D組p-m TOR蛋白表達(dá)均增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與T組比較,R組p-m TOR蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與D組比較,R組p-m TOR蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組m TOR蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。其余組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:頭部淺低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷具有比較明顯的逆轉(zhuǎn)作用,并且具有神經(jīng)保護(hù)作用,其作用機(jī)制與m TOR通路活性的激活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：低溫 缺血再灌注 腦 mTOR 神經(jīng)保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-28
• 結(jié)果28-30
• 附圖30-39
• 附表39-42
• 討論42-45
• 結(jié)論45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 綜述 中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與修復(fù)過程中mTOR通路的作用48-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 個人簡歷62

【二級參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 程元榮;新型強(qiáng)效免疫抑制劑西羅莫司(Sirolimus)的作用機(jī)理、藥物代謝和臨床[J];四川生理科學(xué)雜志;2000年04期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 乜全民;大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬的初步研究[D];蘇州大學(xué);2009年

2 張立沙;自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠腦缺血預(yù)適應(yīng)中的作用和藥物干預(yù)[D];蘇州大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：頭部淺低溫對大鼠全腦缺血再灌注損傷及mTOR通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302520