麻醉是動(dòng)物臨床診療中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),然而麻醉也具有一定的副作用,如引起的神經(jīng)變性,現(xiàn)在已引起廣泛關(guān)注。氯胺酮是臨床常用的靜脈麻醉劑之一,由于其具有良好的鎮(zhèn)痛作用而備受青睞,但同時(shí)它的神經(jīng)毒性作用也是不容忽視的。據(jù)報(bào)道,包括咪達(dá)唑侖在內(nèi)的一些麻醉藥可起到保護(hù)神經(jīng)元的作用,但咪達(dá)唑侖的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。且對(duì)于咪達(dá)唑侖是否能減輕氯胺酮引起的損害,也尚不清楚。因此,為了解對(duì)孕鼠進(jìn)行氯胺酮麻醉時(shí),對(duì)胚胎造成的影響,本實(shí)驗(yàn)通過氯胺酮來麻醉孕鼠,以胎鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,研究氯胺酮對(duì)胎鼠腦神經(jīng)元的影響,以及咪達(dá)唑侖在氯胺酮麻醉時(shí)是否能夠起到保護(hù)作用。為今后尋找相對(duì)安全的麻醉方式提供理論依據(jù)。還可以為懷孕動(dòng)物麻醉提供一些理論支持,盡量避免麻醉對(duì)幼子造成過多的傷害。將懷孕大鼠隨機(jī)分為4組,在懷孕第19天時(shí),對(duì)照組(C組)大鼠不進(jìn)行任何處理,氯胺酮組(K組)大鼠肌注氯胺酮,咪達(dá)唑侖組(M組)大鼠肌注咪達(dá)唑侖,咪達(dá)唑侖+氯胺酮組(K+M組)大鼠同時(shí)肌注氯胺酮和咪達(dá)唑侖,進(jìn)行剖腹產(chǎn),取出胎鼠。采用Western-blot的方法檢測自噬與凋亡的相關(guān)蛋白變化,如微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(autophagy marker light chain3,LC3)、自噬相關(guān)基因4(autophagy-related gene 4,ATG4)、ATG5、Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Beclin-1)、切割的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved-caspase-3,c-caspase-3)、自噬底物P62蛋白(P62)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B細(xì)胞淋巴瘤/白細(xì)胞基因伴隨蛋白x(Bcl-2 associated X protein,Bax)的蛋白變化;用氧化應(yīng)激相關(guān)試劑盒來檢測活性氧(reactive oxygen species,ROS)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測出氯胺酮、咪達(dá)唑侖和過氧化氫對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞的最佳藥物作用濃度,隨后建立氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型,以及加入自噬促進(jìn)劑(Rapa)和抑制劑(3-MA)來進(jìn)行離體驗(yàn)證。應(yīng)用mRFP-EGFP-LC3雙熒光自噬指示體系進(jìn)行檢測,用來研究對(duì)LC3的追蹤以及自噬流的變化。再采用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)來檢測氯胺酮對(duì)PC12細(xì)胞造成的凋亡影響,以及咪達(dá)唑侖在其中起到的作用。再通過Western-blot的方法測定自噬與凋亡相關(guān)蛋白的變化來再次驗(yàn)證得到的在體結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1.氯胺酮通過增加c-caspase-3和Bax的表達(dá),并降低Bcl-2的表達(dá)來誘導(dǎo)胎鼠海馬和PC12細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。2.氯胺酮也增加LC3II、Beclin-1和ATG5蛋白的表達(dá),降低ATG4和P62的表達(dá),最終誘導(dǎo)胎鼠海馬和PC12細(xì)胞發(fā)生自噬。3.氯胺酮促進(jìn)ROS和MDA的產(chǎn)生,降低T-AOC。4.K+M組與K組相比,自噬與凋亡相關(guān)蛋白有顯著差異性(P0.05)。5.M組與C組相比,自噬與凋亡相關(guān)蛋白沒有明顯變化。結(jié)果表明氯胺酮麻醉導(dǎo)致胎鼠海馬發(fā)生自噬和細(xì)胞凋亡。氯胺酮還通過ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)凋亡途徑和自噬的激活,從而在神經(jīng)元中誘導(dǎo)毒性。咪達(dá)唑侖通過降低ROS的產(chǎn)生來改善氯胺酮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S859.7
【部分圖文】：

管理和樣品收集懷孕的雌性大鼠隨機(jī)分為以下 4 組（每組 n = 6）：對(duì)照組（C），氯胺酮M），氯胺酮和咪達(dá)唑侖聯(lián)合組（K + M）。在 G19（相當(dāng)于人類懷孕]時(shí)，讓 C 組大鼠在籠中不受干擾；K 組大鼠通過肌肉注射氯胺酮（上買）（先按劑量為 80 mg/kg 進(jìn)行肌肉注射，隨后每隔 1 h 按劑量為 40 以保證氯胺酮穩(wěn)定的血藥濃度）；M 組大鼠通過肌肉注射咪達(dá)唑侖（，中國江蘇）（劑量為 60 mg/kg）；K + M 組大鼠在通過肌肉注射氯胺 進(jìn)行肌肉注射，隨后每隔 1 h 按劑量為 40 mg/kg 進(jìn)行補(bǔ)液三次）前 30 劑量為 60 mg/kg），氯胺酮的總體積小于 2 mL/100 g 體重，一共藥物持這種輸注方式誘導(dǎo)大鼠處于輕度麻醉和深度鎮(zhèn)靜之間的鎮(zhèn)靜狀態(tài)，但不過翻正反射消失、肌肉緊張度減少和對(duì)疼痛的最小反應(yīng)來確認(rèn)是否達(dá)，通過斷頭方式來處死大鼠，并回收胎兒，剝離腦殼，將整個(gè)腦組織放皮層并收集海馬組織（海馬位置示意圖如圖 2-1）。海馬組織收集后應(yīng)存。本實(shí)驗(yàn)使用來自 3 個(gè)母鼠（3 個(gè)胎鼠/母鼠）的 9 只胎鼠。將取自胎兒的海馬組織混合在一起，提取蛋白，將此混合的海馬組織作為一一個(gè)數(shù)據(jù)。

果胺酮和咪達(dá)唑侖對(duì)胎鼠海馬中自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)施用氯胺酮后，LC3II、ATG5、Beclin-1、c-caspase-3 和 Bax 分別上調(diào)了 83.5%、132.844%和 104.9%，而 ATG4，自噬底物 P62 蛋白——P62（SQSTM1）和 Bcl-2 分別%、38.9%和 56.1%（見圖 3-1）。M 組與 C 組相比，可以發(fā)現(xiàn)，沒有明顯的趨勢變了更好的表達(dá) LC3-I 與 LC3-II 和 Bax 與 Bcl-2 之間的轉(zhuǎn)換，本實(shí)驗(yàn)做了 LC3-I/LC/Bcl-2 的比值柱狀圖。通過分析發(fā)現(xiàn)，K 組與 C 組相比，LC3-I/LC3-II 的比值發(fā) Bax/Bcl-2 的比值變高（P<0.05，見圖 3-1）；同時(shí) M 組相對(duì)于 C 組無明顯變化。

圖 3-2 胎鼠海馬和 PC12 細(xì)胞中 T-AOC、MDA 和 ROS 的變化Figure 3-2 Changes of T-AOC，MDA and ROS in fetal rat hippocampus and PC12 cells3.3 咪達(dá)唑侖減弱氯胺酮對(duì)胎鼠海馬的影響本實(shí)驗(yàn)檢測了胎鼠海馬中自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量，以及氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)。通過結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，K+M 組與 K 組相比，c-caspase-3、Beclin-1、Bax、ATG5 和 LC3-II 分別下調(diào)了 22.3%、33.9%、56%、51%和 31.3%；而 Bcl-2、ATG4、和 P62 上調(diào)了 72.9%、71.1%、和 65.8%（見圖 3-1）。在氧化應(yīng)激方面，本實(shí)驗(yàn)檢測了 T-AOC、ROS 和 MDA 的含量，發(fā)現(xiàn)，K+M 組與 K 組相比，T-AOC 發(fā)生上升，為 2.16±0.029 U/mgprot；而 ROS 和 MDA 的含量下降，分別為 4383.33±102.74（DCF Flurescenxe）和 1.33±0.042 nmol/mgprot（見圖 3-2）。3.4 氯胺酮和咪達(dá)唑侖和過氧化氫對(duì) PC12 細(xì)胞的最佳藥物作用濃度的確定本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 PC12 細(xì)胞進(jìn)行了離體驗(yàn)證。應(yīng)用 CCK-8 試劑盒來檢測氯胺酮，咪達(dá)唑侖和過氧化氫對(duì) PC12 細(xì)胞的最佳藥物作用濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)氯胺酮和過氧化氫濃度分別為 0.6
【參考文獻(xiàn)】

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1 黃陳平;林林;宋明芬;方周溪;;氯胺酮對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元的影響[J];毒理學(xué)雜志;2007年03期

2 郭忠英;咪達(dá)唑侖、氯胺酮合劑在小兒外科手術(shù)中的應(yīng)用[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2003年05期

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1 趙天云;孕中期大鼠母體氨胺酮麻醉致子鼠海馬發(fā)育異常及情緒障礙[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2838233