研究背景 腦中風(fēng)是導(dǎo)致全球人類(lèi)死亡的主要疾病,是第三大致死病因僅次于心臟病和癌癥。同時(shí),50%-70%存活者具有嚴(yán)重的后遺癥,包括癱瘓,失語(yǔ)等。其中缺血性腦中風(fēng)是腦中風(fēng)的主要類(lèi)型,發(fā)病率約占腦卒中的80%,具有發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高等特點(diǎn),給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。 臨床上盡快恢復(fù)腦損傷后的血液供應(yīng),挽救瀕臨死亡的腦細(xì)胞是減輕腦缺血后腦損傷的關(guān)鍵。目前,在急性腦缺血早期靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的溶栓治療手段。但是由于其存在很窄的治療窗以及血液再灌注誘導(dǎo)的二次損傷,臨床證明只有少部分患者從中獲益。因此,研究藥物保護(hù)血液再灌注誘導(dǎo)的二次損傷是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。 腦缺血再灌注損傷會(huì)激活一系列錯(cuò)綜復(fù)雜的生理病理反應(yīng)：氧化應(yīng)激,鈣超載,興奮性氨基酸,炎癥,細(xì)胞凋亡等,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其中氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中扮演及其重要的角色。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,已知多種藥物可作用于該復(fù)雜的病理過(guò)程,對(duì)腦缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用。①抗氧化劑：這類(lèi)藥物可清除由再灌注誘導(dǎo)的過(guò)量的自由基,改善氧化應(yīng)激,證實(shí)對(duì)腦缺血再灌注有保護(hù)作用,如依達(dá)拉奉目前廣泛應(yīng)用于治療急性缺血性腦卒中。②抗生素：研究人員發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類(lèi)藥物通過(guò)減弱細(xì)胞免疫性以及阻斷細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)保護(hù)腦卒中。③生長(zhǎng)因子：生長(zhǎng)因子通過(guò)抗凋亡和抗炎作用減輕腦卒中后的損傷,而且可促進(jìn)神經(jīng)和血管再生,如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)等。④鈣離子通道抑制劑：通過(guò)提高Na+-K+-ATP酶的活性,維持細(xì)胞膜的正常功能,保證腦內(nèi)離子穩(wěn)定,防止缺血再灌注后腦細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載造成的損壞,從而發(fā)揮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究證明尼莫地平對(duì)急性腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。⑤抗炎癥藥物：炎癥是腦缺血再灌注損傷中主要的病理特征,抗炎藥物通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和降低黏附分子的表達(dá)而抑制炎癥過(guò)程,保護(hù)腦組織。實(shí)驗(yàn)研究證明高劑量抗炎藥物布洛芬可以干擾白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用,通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)產(chǎn)生抗腦損傷作用。⑥中藥：中藥對(duì)缺血性腦卒中的顯著臨床療效使其成為神經(jīng)保護(hù)藥物的重要研究對(duì)象,越來(lái)越多的證據(jù)表明中藥對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。川芎嗪、燈盞花注射液、銀杏葉制劑、丹參注射液、紅景天等藥物從不同途徑、不同環(huán)節(jié)對(duì)缺血性腦卒中病人起到一定的腦保護(hù)作用。 α-硫辛酸(LA)是一種存在于線粒體的酶,屬于硫醇類(lèi)化合物,具有很強(qiáng)的抗氧化性。LA既水溶性也脂溶性,很容易分布到機(jī)體內(nèi)各個(gè)組織中,被稱(chēng)為“萬(wàn)能抗氧化劑”,是人類(lèi)不可或缺的抗氧化劑。在體內(nèi)LA轉(zhuǎn)化為二氫硫辛酸(DHLA),兩者都具有很強(qiáng)的抗氧化性。LA具有多種生物活性：清除自由基,再生其他抗氧化劑,抗炎,抗凋亡,螯合金屬離子等。LA現(xiàn)在臨床主要應(yīng)用于糖尿病周?chē)窠?jīng)病變,但是國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)LA對(duì)多種疾病具有潛在的治療價(jià)值,如糖尿病腎病,阿爾茨海默病,帕金森綜合癥,缺血再灌注,衰老以及重金屬中毒等。實(shí)驗(yàn)證明LA對(duì)多種組織缺血再灌注具有保護(hù)作用,包括心臟、周?chē)窠?jīng)、睪丸、視網(wǎng)膜以及大腦等。過(guò)去有關(guān)研究表明LA治療心肌組織缺血再灌注損傷是通過(guò)激活PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路,這兩個(gè)信號(hào)通路對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡起著關(guān)鍵性作用。但是,據(jù)我們所知很少研究涉及LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及其作用機(jī)制。所以本文研究了LA在大鼠腦缺血再灌注模型中保護(hù)大腦功能的藥效學(xué)及其作用機(jī)制。 目的 本實(shí)驗(yàn)采用改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型,研究LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注的藥效作用,同時(shí)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討。 方法 1.建立SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型 大鼠術(shù)前禁食12小時(shí)但不禁水。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉,用75%乙醇消毒大鼠頸部皮膚,在頸部正中切開(kāi)皮膚,剪開(kāi)前筋膜,鈍性分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和迷走神經(jīng)。往遠(yuǎn)心端找出并分離頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。臨時(shí)結(jié)扎CCA,動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)ICA,結(jié)扎并切斷左側(cè)ECA,下拉近心端,與左側(cè)ICA呈直線。然后在ECA近分叉處用眼科剪45。剪一小斜口由此插入制備好的線栓,松開(kāi)動(dòng)脈夾,緩慢向ICA插入線栓,直到推進(jìn)至分叉處18-20mm遇阻力即止。松開(kāi)CCA,縫合皮膚。阻斷血流90分鐘后,拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。整個(gè)手術(shù)期間用臺(tái)燈保證大鼠體溫為37℃。再灌注24小時(shí)之后,采用Longa評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分：0分：正常；1分：腦缺血對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展；2分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物爬行時(shí)向缺血對(duì)側(cè)傾倒；4分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。 2.LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注治療作用的初步藥效學(xué)研究 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)(n=12),模型組(I/R)(n=12), LA低劑量組(L-LA)(n=6),LA中劑量組(M-LA)(n=6),LA高劑量組(H-LA)(n=12)。假手術(shù)組：不插入線栓,其他操作與其他組別一樣；模型組：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射等量生理鹽水；LA低劑量組：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射50mg/kg LA;LA中劑量組：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射70mg/kg LA; LA高劑量組：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射100mg/kg LA。LA粉末混懸于生理鹽水,然后加入1M NaOH溶液,待LA完全溶解之后,用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值為7.4,過(guò)0.22μm濾膜。大鼠再灌注24小時(shí)之后,用Longa評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉并處死大鼠,通過(guò)TTC染色觀察各組大鼠腦缺血再灌注之后梗死范圍以及測(cè)量其梗死面積,用干濕法測(cè)量腦缺血側(cè)大腦水含量,并使用尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)完整性。 3.LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)損傷治療作用的機(jī)制研究 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham);模型組(I/R)：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射等量生理鹽水；LA給藥組(LA)：大腦中動(dòng)脈阻塞前2小時(shí)皮下注射100mg/kg LA;每組6只。大鼠缺血90分鐘再灌注24小時(shí)之后麻醉并處死,測(cè)定大腦組織相關(guān)的氧化指標(biāo)：丙二醛(MDA),一氧化氮(NO),過(guò)氧化物歧化酶(SOD),總抗氧化能力(T-AOC)。同時(shí),利用western blot方法檢測(cè)腦組織Cleaved caspase-3、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蘇氨酸／絲氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白在各組大鼠大腦組織中的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)保護(hù)治療作用的初步研究 大鼠腦缺血90分鐘再灌注24小時(shí)后,發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組,模型組和給藥組,在神經(jīng)功能活動(dòng)上有不同的表現(xiàn)。模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高,與假手術(shù)組比較差異具有顯著性(P0.05)；與模型組比較,LA高劑量組顯著降低神經(jīng)功能評(píng)分(P0.05),LA低劑量組和中劑量組沒(méi)有明顯改變(P0.05)。與模型組比較,LA高劑量組的腦梗死面積明顯減少(P0.05)；LA低劑量組和中劑量組與模型組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。腦缺血再灌注可以誘導(dǎo)大腦含水量明顯升高,導(dǎo)致大鼠腦水腫,100mg/kg LA能夠明顯降低大鼠腦含水量(P0.05),增加海馬CA1區(qū)尼氏陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞。 2.LA對(duì)大鼠腦缺血再灌注治療作用的機(jī)制研究 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織的MDA和NO含量顯著升高(P0.05),但是SOD以及T-AOC活性明顯下降(P0.05),LA能夠降低腦組織中的MDA和NO的含量以及提高SOD和T-AOC的活性,差異具有顯著性(P0.05)。與模型組比較,LA組的Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著下降(P0.05)；與模型組比較,LA組的BDNF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA組的PI3K蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA組的p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA高劑量組的p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)。 結(jié)論 1.LA可以改善大鼠神經(jīng)功能缺損,減少腦梗死面積以及減輕腦水腫,增加海馬CAl區(qū)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞,提示對(duì)腦缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用。 2.LA能夠降低腦組織中MDA和NO含量,增強(qiáng)SOD和T-AOC活性,從而改善由腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激水平,提高腦細(xì)胞的抗氧化能力；同時(shí)LA能夠降低Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá),抑制Caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡。 3.LA的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)增加腦組織中BDNF蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步激活PI3K/Akt以及ERK1/2信號(hào)通路。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類(lèi)】：R743.3
【部分圖文】：

圖1-1 LA對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響(11=6)e 1-1 Effect of LA on the neurologic deficit scores in cerebral I/R ra據(jù)以均值士方差的形式表示，其中.P<0.05表示與模型組比較，hsm：假手術(shù)組；I/R:模型組；L-LA： LA低劑量組（50mg/k（70nig/kg); H-LA： LA 高劑量組（lOOmg/kg)。Neurological de神經(jīng)功能評(píng)分。缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響手術(shù)組中大鼠腦組織TTC染色顯示出均勻的紅色，沒(méi)中缺血側(cè)腦組織TTC染色表現(xiàn)為大范圍白色梗死區(qū)域。梗死面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05); L-LA組梗死面積有所減小，但是差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

圖1-2 LA對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響（n=6)Figure 1-2 Effect of LA on cerebral infract size in cerebral I/R rats (n=6)注：以上數(shù)據(jù)以均值士方差的形式表示，其中*P<0.05表示與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。Shsm:假手術(shù)組；1/R:模型組；L-LA: LA低劑量組（50mg/kg); M-LA：

差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05);與模型組比較，LA組大鼠腦組織的Cleavedcaspase-3的表達(dá)顯著下降（P〈0.05)，見(jiàn)圖2-1。ASham ] 'R ！ A Sham I/R IA.1 一? Cleaved caspase-3B4.0-f *名 3.0-_■tiJjLSham iTr LA圖2-1各組大鼠腦組織中Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)（n=3)Figure 2-1 The expression of the cleaved caspase-3 protein of the rat's brain tissue in each group(n=3)注：以上數(shù)據(jù)以均值土方差的形式表示，其中><0.05表示與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;#P<0.05表示與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Shsm:假手術(shù)組；I/R:模型組；LA: LA給藥組（lOOmg/kg)。3.3 hAMBBm, PI3K, p-Akt, p-ERKl/2蛋白表達(dá)的影響。與模型組比較，LA組大鼠的BDNF蛋白含量顯著升高（P<0.05),見(jiàn)圖2-2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的PmC和p-Akt蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05)，LA組的PI3K和p-Akt含量明顯上升，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，見(jiàn)圖2-3。模型組大鼠與假手術(shù)組比較，蛋白P-ERK1/2的表達(dá)有所升高
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2835254