研究背景 腦中風是導致全球人類死亡的主要疾病,是第三大致死病因僅次于心臟病和癌癥。同時,50%-70%存活者具有嚴重的后遺癥,包括癱瘓,失語等。其中缺血性腦中風是腦中風的主要類型,發(fā)病率約占腦卒中的80%,具有發(fā)病率高、致殘率高、復發(fā)率高、死亡率高等特點,給家庭和社會帶來沉重的負擔。 臨床上盡快恢復腦損傷后的血液供應,挽救瀕臨死亡的腦細胞是減輕腦缺血后腦損傷的關鍵。目前,在急性腦缺血早期靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的溶栓治療手段。但是由于其存在很窄的治療窗以及血液再灌注誘導的二次損傷,臨床證明只有少部分患者從中獲益。因此,研究藥物保護血液再灌注誘導的二次損傷是近年來研究的熱點。 腦缺血再灌注損傷會激活一系列錯綜復雜的生理病理反應：氧化應激,鈣超載,興奮性氨基酸,炎癥,細胞凋亡等,最終導致細胞死亡。其中氧化應激和細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中扮演及其重要的角色。在動物實驗中,已知多種藥物可作用于該復雜的病理過程,對腦缺血再灌注具有一定的保護作用。①抗氧化劑：這類藥物可清除由再灌注誘導的過量的自由基,改善氧化應激,證實對腦缺血再灌注有保護作用,如依達拉奉目前廣泛應用于治療急性缺血性腦卒中。②抗生素：研究人員發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類藥物通過減弱細胞免疫性以及阻斷細胞凋亡級聯(lián)反應保護腦卒中。③生長因子：生長因子通過抗凋亡和抗炎作用減輕腦卒中后的損傷,而且可促進神經和血管再生,如腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等。④鈣離子通道抑制劑：通過提高Na+-K+-ATP酶的活性,維持細胞膜的正常功能,保證腦內離子穩(wěn)定,防止缺血再灌注后腦細胞內Ca2+超載造成的損壞,從而發(fā)揮保護作用。實驗研究證明尼莫地平對急性腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。⑤抗炎癥藥物：炎癥是腦缺血再灌注損傷中主要的病理特征,抗炎藥物通過抑制中性粒細胞浸潤和降低黏附分子的表達而抑制炎癥過程,保護腦組織。實驗研究證明高劑量抗炎藥物布洛芬可以干擾白細胞和內皮細胞之間相互作用,通過抑制內皮細胞黏附分子的表達產生抗腦損傷作用。⑥中藥：中藥對缺血性腦卒中的顯著臨床療效使其成為神經保護藥物的重要研究對象,越來越多的證據(jù)表明中藥對腦缺血具有保護作用。川芎嗪、燈盞花注射液、銀杏葉制劑、丹參注射液、紅景天等藥物從不同途徑、不同環(huán)節(jié)對缺血性腦卒中病人起到一定的腦保護作用。 α-硫辛酸(LA)是一種存在于線粒體的酶,屬于硫醇類化合物,具有很強的抗氧化性。LA既水溶性也脂溶性,很容易分布到機體內各個組織中,被稱為“萬能抗氧化劑”,是人類不可或缺的抗氧化劑。在體內LA轉化為二氫硫辛酸(DHLA),兩者都具有很強的抗氧化性。LA具有多種生物活性：清除自由基,再生其他抗氧化劑,抗炎,抗凋亡,螯合金屬離子等。LA現(xiàn)在臨床主要應用于糖尿病周圍神經病變,但是國內外學者發(fā)現(xiàn)LA對多種疾病具有潛在的治療價值,如糖尿病腎病,阿爾茨海默病,帕金森綜合癥,缺血再灌注,衰老以及重金屬中毒等。實驗證明LA對多種組織缺血再灌注具有保護作用,包括心臟、周圍神經、睪丸、視網膜以及大腦等。過去有關研究表明LA治療心肌組織缺血再灌注損傷是通過激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路,這兩個信號通路對于促進細胞增殖、分化以及凋亡起著關鍵性作用。但是,據(jù)我們所知很少研究涉及LA對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用及其作用機制。所以本文研究了LA在大鼠腦缺血再灌注模型中保護大腦功能的藥效學及其作用機制。 目的 本實驗采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈腦缺血再灌注模型,研究LA對大鼠腦缺血再灌注的藥效作用,同時對其作用機理進行初步探討。 方法 1.建立SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型 大鼠術前禁食12小時但不禁水。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉,用75%乙醇消毒大鼠頸部皮膚,在頸部正中切開皮膚,剪開前筋膜,鈍性分離胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的間隙,分離左側頸總動脈(CCA)和迷走神經。往遠心端找出并分離頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。臨時結扎CCA,動脈夾夾閉左側ICA,結扎并切斷左側ECA,下拉近心端,與左側ICA呈直線。然后在ECA近分叉處用眼科剪45。剪一小斜口由此插入制備好的線栓,松開動脈夾,緩慢向ICA插入線栓,直到推進至分叉處18-20mm遇阻力即止。松開CCA,縫合皮膚。阻斷血流90分鐘后,拔出線栓實現(xiàn)再灌注。整個手術期間用臺燈保證大鼠體溫為37℃。再灌注24小時之后,采用Longa評分法對大鼠神經功能進行評分：0分：正常；1分：腦缺血對側前肢不能完全伸展；2分：實驗動物向缺血對側轉圈；3分：實驗動物爬行時向缺血對側傾倒；4分：實驗動物不能自發(fā)行走,意識喪失。 2.LA對大鼠腦缺血再灌注治療作用的初步藥效學研究 大鼠隨機分為假手術組(Sham)(n=12),模型組(I/R)(n=12), LA低劑量組(L-LA)(n=6),LA中劑量組(M-LA)(n=6),LA高劑量組(H-LA)(n=12)。假手術組：不插入線栓,其他操作與其他組別一樣；模型組：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射等量生理鹽水；LA低劑量組：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射50mg/kg LA;LA中劑量組：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射70mg/kg LA; LA高劑量組：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射100mg/kg LA。LA粉末混懸于生理鹽水,然后加入1M NaOH溶液,待LA完全溶解之后,用稀鹽酸調節(jié)溶液pH值為7.4,過0.22μm濾膜。大鼠再灌注24小時之后,用Longa評分法對大鼠神經功能進行評分。用10%水合氯醛(3.5ml/kg)麻醉并處死大鼠,通過TTC染色觀察各組大鼠腦缺血再灌注之后梗死范圍以及測量其梗死面積,用干濕法測量腦缺血側大腦水含量,并使用尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)完整性。 3.LA對大鼠腦缺血再灌注誘導損傷治療作用的機制研究 大鼠隨機分為假手術組(Sham);模型組(I/R)：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射等量生理鹽水；LA給藥組(LA)：大腦中動脈阻塞前2小時皮下注射100mg/kg LA;每組6只。大鼠缺血90分鐘再灌注24小時之后麻醉并處死,測定大腦組織相關的氧化指標：丙二醛(MDA),一氧化氮(NO),過氧化物歧化酶(SOD),總抗氧化能力(T-AOC)。同時,利用western blot方法檢測腦組織Cleaved caspase-3、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蘇氨酸／絲氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白在各組大鼠大腦組織中的表達情況。 結果 1.LA對大鼠腦缺血再灌注神經保護治療作用的初步研究 大鼠腦缺血90分鐘再灌注24小時后,發(fā)現(xiàn)假手術組,模型組和給藥組,在神經功能活動上有不同的表現(xiàn)。模型組大鼠神經功能評分明顯增高,與假手術組比較差異具有顯著性(P0.05)；與模型組比較,LA高劑量組顯著降低神經功能評分(P0.05),LA低劑量組和中劑量組沒有明顯改變(P0.05)。與模型組比較,LA高劑量組的腦梗死面積明顯減少(P0.05)；LA低劑量組和中劑量組與模型組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。腦缺血再灌注可以誘導大腦含水量明顯升高,導致大鼠腦水腫,100mg/kg LA能夠明顯降低大鼠腦含水量(P0.05),增加海馬CA1區(qū)尼氏陽性神經元細胞。 2.LA對大鼠腦缺血再灌注治療作用的機制研究 與假手術組比較,模型組大鼠腦組織的MDA和NO含量顯著升高(P0.05),但是SOD以及T-AOC活性明顯下降(P0.05),LA能夠降低腦組織中的MDA和NO的含量以及提高SOD和T-AOC的活性,差異具有顯著性(P0.05)。與模型組比較,LA組的Cleaved caspase-3蛋白表達顯著下降(P0.05)；與模型組比較,LA組的BDNF蛋白表達水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA組的PI3K蛋白表達水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA組的p-Akt蛋白表達水平明顯升高(P0.05)；與模型組比較,LA高劑量組的p-ERK1/2蛋白表達水平明顯升高(P0.05)。 結論 1.LA可以改善大鼠神經功能缺損,減少腦梗死面積以及減輕腦水腫,增加海馬CAl區(qū)尼氏染色陽性神經元細胞,提示對腦缺血再灌注具有一定的保護作用。 2.LA能夠降低腦組織中MDA和NO含量,增強SOD和T-AOC活性,從而改善由腦缺血再灌注誘導的氧化應激水平,提高腦細胞的抗氧化能力；同時LA能夠降低Cleaved caspase-3蛋白的表達,抑制Caspase依賴的細胞凋亡。 3.LA的神經保護作用可能是通過增加腦組織中BDNF蛋白表達水平,進一步激活PI3K/Akt以及ERK1/2信號通路。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

圖1-1 LA對腦缺血再灌注大鼠神經功能評分的影響(11=6)e 1-1 Effect of LA on the neurologic deficit scores in cerebral I/R ra據(jù)以均值士方差的形式表示，其中.P<0.05表示與模型組比較，hsm：假手術組；I/R:模型組；L-LA： LA低劑量組（50mg/k（70nig/kg); H-LA： LA 高劑量組（lOOmg/kg)。Neurological de神經功能評分。缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響手術組中大鼠腦組織TTC染色顯示出均勻的紅色，沒中缺血側腦組織TTC染色表現(xiàn)為大范圍白色梗死區(qū)域。梗死面積明顯減小，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05); L-LA組梗死面積有所減小，但是差異不具有統(tǒng)計學意

圖1-2 LA對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積的影響（n=6)Figure 1-2 Effect of LA on cerebral infract size in cerebral I/R rats (n=6)注：以上數(shù)據(jù)以均值士方差的形式表示，其中*P<0.05表示與模型組比較，統(tǒng)計學上有顯著性差異。Shsm:假手術組；1/R:模型組；L-LA: LA低劑量組（50mg/kg); M-LA：

差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05);與模型組比較，LA組大鼠腦組織的Cleavedcaspase-3的表達顯著下降（P〈0.05)，見圖2-1。ASham ] 'R ！ A Sham I/R IA.1 一? Cleaved caspase-3B4.0-f *名 3.0-_■tiJjLSham iTr LA圖2-1各組大鼠腦組織中Cleaved caspase-3蛋白的表達（n=3)Figure 2-1 The expression of the cleaved caspase-3 protein of the rat's brain tissue in each group(n=3)注：以上數(shù)據(jù)以均值土方差的形式表示，其中><0.05表示與假手術組比較有統(tǒng)計學差異;#P<0.05表示與模型組比較有統(tǒng)計學差異。Shsm:假手術組；I/R:模型組；LA: LA給藥組（lOOmg/kg)。3.3 hAMBBm, PI3K, p-Akt, p-ERKl/2蛋白表達的影響。與模型組比較，LA組大鼠的BDNF蛋白含量顯著升高（P<0.05),見圖2-2。與假手術組比較，模型組大鼠的PmC和p-Akt蛋白表達顯著下降（P<0.05)，LA組的PI3K和p-Akt含量明顯上升，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，見圖2-3。模型組大鼠與假手術組比較，蛋白P-ERK1/2的表達有所升高
【參考文獻】

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1 孫志強;陳寶平;;糖尿病腎病研究進展[J];中華實用診斷與治療雜志;2010年06期

2 張武平;陳麗;姚娜;陳蕾;張彩平;;前列地爾聯(lián)合硫辛酸治療早期糖尿病腎病的臨床療效觀察[J];實用糖尿病雜志;2013年02期

3 尹志奎,崔泰震,崔旭,李文彬,鄭風勁;α-硫辛酸對果蠅壽命的影響[J];齊齊哈爾醫(yī)學院學報;2004年06期

4 湯春芳,劉云國,徐衛(wèi)華,李程峰;硫辛酸的研究概況[J];中國生化藥物雜志;2005年01期

5 李安林;;α-硫辛酸的研究進展[J];食品科技;2008年04期

6 李晶;郭利平;;線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的研究進展[J];天津中醫(yī)藥大學學報;2008年01期

7 張曉迪,海春旭,梁欣,趙康濤,秦緒軍,陳紅利,劉瑞;硫辛酸的急性毒性及抗輻射作用初步研究[J];衛(wèi)生毒理學雜志;2002年04期

8 晉陽;霍麗娟;;α-硫辛酸對酒精性肝損傷大鼠的治療作用[J];中國醫(yī)療前沿;2010年09期

9 付宏亮;張剛利;張漢偉;史建軍;;線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型研究[J];中國藥物與臨床;2010年01期

10 吳聰;朱麗麗;楊永蘭;吳秋萍;施用暉;樂國偉;;硫辛酸對高脂飼養(yǎng)小鼠氧化應激及血糖血脂的影響[J];營養(yǎng)學報;2010年05期

本文編號：2835254