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下丘腦穹窿周區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞在吸入麻醉覺(jué)醒過(guò)程中的作用研究

發(fā)布時(shí)間:2020-10-08 23:00
   研究背景全身麻醉是指麻醉藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種可逆的意識(shí)消失、鎮(zhèn)痛和制動(dòng)狀態(tài)。全麻藥物的應(yīng)用極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)特別是外科手術(shù)及無(wú)痛檢查的發(fā)展,然而其作用的核心機(jī)制至今仍未被解析清楚。過(guò)去在全麻機(jī)制的研究中,著重于圍繞神經(jīng)元尋找全麻藥物的作用靶點(diǎn)和相關(guān)機(jī)制。而星形膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞,在全麻機(jī)制的研究中卻一直未得到關(guān)注,相關(guān)報(bào)道罕見(jiàn)。研究證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞參與睡眠-覺(jué)醒穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié),調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)既可產(chǎn)生促睡眠作用,亦可產(chǎn)生促覺(jué)醒效應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)睡眠-覺(jué)醒的雙向調(diào)控作用是由其釋放的多種膠質(zhì)遞質(zhì)及能量物質(zhì)所介導(dǎo)的,包括谷氨酸、腺苷、ATP、乳酸等。全身麻醉過(guò)程與睡眠有許多相似之處,也共享多條神經(jīng)環(huán)路。已有大量證據(jù)表明,位于Pef區(qū)的Orexin神經(jīng)元在睡眠-覺(jué)醒和麻醉-覺(jué)醒過(guò)程中為促覺(jué)醒神經(jīng)元。然而,星形膠質(zhì)細(xì)胞是否通過(guò)調(diào)控Orexin神經(jīng)元參與麻醉覺(jué)醒的調(diào)節(jié)尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)離體與在體兩部分實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Orexin神經(jīng)元興奮性的影響,進(jìn)而觀察了其對(duì)麻醉覺(jué)醒過(guò)程的調(diào)節(jié),特別關(guān)注了星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸是否介導(dǎo)這一過(guò)程。第一部分Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Orexin神經(jīng)元興奮性調(diào)控作用的研究【目的】(1)觀察FC抑制Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞后,Orexin神經(jīng)元興奮性的變化。(2)觀察FC抑制Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞后,原代培養(yǎng)神經(jīng)元興奮性的變化。(3)觀察化學(xué)遺傳學(xué)手段抑制Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞后Orexin神經(jīng)元興奮性的變化。(4)觀察4-CIN抑制神經(jīng)元乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體后,Orexin神經(jīng)元興奮性的變化。【方法】(1)4-6周齡,雄性C57BL/6小鼠。切取含Pef區(qū)的腦片,鉗制細(xì)胞記錄灌流FC(5μM)對(duì)Orexin神經(jīng)元自發(fā)放電(n=7)、靜息膜電位(n=7)、自發(fā)興奮性突觸后電流(n=5)、自發(fā)抑制性突觸后電流的影響(n=5),四種指標(biāo)的記錄過(guò)程均為:基線5min,FC灌流5min,洗脫期10min。(2)取E18d胎鼠,原代培養(yǎng)神經(jīng)元。記錄灌流FC(5μM)前、后,神經(jīng)元靜息膜電位(n=6)的變化。(3)3-4周齡,Fgfr3-icre ERT小鼠。雙側(cè)Pef區(qū)注射AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m CherryWPRE-p A病毒,病毒表達(dá)成功后,切取含Pef區(qū)的腦片,孵育后鉗制細(xì)胞記錄灌流CNO(10μM)對(duì)Orexin神經(jīng)元自發(fā)放電(n=6)的影響。(4)4-6周齡,Orexin-GFP-2A-cre小鼠。切取含Pef區(qū)的腦片,孵育后鉗制細(xì)胞記錄灌流神經(jīng)元乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCT2)抑制劑4-CIN(0.5m M)后對(duì)Orexin神經(jīng)元自發(fā)放電(n=5)的影響。【結(jié)果】(1)在腦片上,FC灌流后,Orexin神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯下降(**P0.01)。灌流后靜息膜電位下降,絕對(duì)值增加(n=7,**P0.01),提示FC使Orexin神經(jīng)元明顯超極化,興奮性降低。FC灌流后,Orexin神經(jīng)元的s EPSC、s IPSC未見(jiàn)明顯變化。(2)在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元,FC灌流后,神經(jīng)元的靜息膜電位未見(jiàn)明顯變化。(3)化學(xué)遺傳學(xué)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后,Orexin神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率明顯下降(*P0.05)。(4)在Orexin-GFP-2A-cre動(dòng)物腦片上,4-CIN灌流后,Orexin神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯下降(*P0.05)。第二部分Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞在Orexin神經(jīng)元促麻醉覺(jué)醒中的作用研究【目的】(1)觀察FC抑制Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞后,小鼠異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間的變化。(2)觀察化學(xué)遺傳學(xué)手段抑制Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞后,小鼠異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間的變化。(3)觀察4-CIN抑制神經(jīng)元乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體后,小鼠異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間以及腦電的變化!痉椒ā(1)8周齡,雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為兩組(n=6),單側(cè)Pef區(qū)埋置微注射套管,一周后監(jiān)測(cè)給予FC(1pmol)后異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間。將小鼠置于轉(zhuǎn)筒中適應(yīng)10min,打開(kāi)麻醉機(jī),維持氧流量為1L/min,異氟烷濃度為1.4%,小鼠翻正反射消失后通醚30min,停醚后記錄小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間,即麻醉覺(jué)醒時(shí)間。同樣方法記錄單側(cè)Pef區(qū)給予50pmol(n=7)、100pmol(n=8)FC后,小鼠的翻正反射恢復(fù)時(shí)間。雙側(cè)Pef區(qū)置管,記錄給予1pmol(n=8)、50pmol(n=8)、100pmol(n=8)FC后,小鼠的翻正反射恢復(fù)時(shí)間。(2)8周齡,雄性Fgfr3-icre ERT小鼠,隨機(jī)分為兩組(n=7)行雙側(cè)Pef區(qū)病毒微注射,其中實(shí)驗(yàn)組注射AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m Cherry-WPRE-p A病毒200nl,對(duì)照組注射AAV-EF1α-DIO-m Cherry-WPRE-p A對(duì)照病毒,病毒表達(dá)兩周后監(jiān)測(cè)異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間,麻醉前15min腹腔注射CNO(1mg/kg),停醚后記錄小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間,即麻醉覺(jué)醒時(shí)間。(3)8周齡,雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為兩組(n=7),埋置單側(cè)Pef區(qū)微注射套管,一周后監(jiān)測(cè)予4-CIN(0.4nmol)后異氟烷麻醉覺(jué)醒時(shí)間。將小鼠置于轉(zhuǎn)筒中適應(yīng)10min,打開(kāi)麻醉機(jī),維持氧流量為1L/min,異氟烷濃度為1.4%,通醚30min,停醚后記錄小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間,即麻醉覺(jué)醒時(shí)間;同樣的,記錄雙側(cè)Pef區(qū)予4-CIN后小鼠(n=8)異氟烷麻醉翻正反射恢復(fù)時(shí)間;監(jiān)測(cè)雙側(cè)Pef區(qū)予4-CIN后小鼠的異氟烷麻醉腦電變化。【結(jié)果】(1)單、雙側(cè)Pef區(qū)分別注射1pmol、50pmol、100pmol FC后小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間無(wú)明顯改變,與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)AAV-EF1α-DIO-h M4Di-m Cherry-WPRE-p A組小鼠給予CNO后動(dòng)物麻醉翻正反射恢復(fù)時(shí)間與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)單、雙側(cè)Pef區(qū)注射4-CIN后小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間顯著延長(zhǎng),與對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(**P0.01),且雙側(cè)Pef注射4-CIN后小鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間較單側(cè)延長(zhǎng)。4-CIN組小鼠腦電時(shí)頻圖抑制性腦電波比例較對(duì)照組大。停醚后,對(duì)照組小鼠覺(jué)醒時(shí),4-CIN組小鼠腦電仍表現(xiàn)為爆發(fā)性抑制波!拘〗Y(jié)】(1)本課題第一部分離體電生理實(shí)驗(yàn)顯示:利用FC藥理學(xué)阻斷及化學(xué)遺傳學(xué)方法抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后Orexin神經(jīng)元的興奮性明顯下降。同時(shí)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸向Orexin神經(jīng)元轉(zhuǎn)運(yùn)后,Orexin神經(jīng)元的興奮性也明顯受到抑制,提示星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸在維持Orexin神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮著重要作用。(2)第二部分在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示:給予乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑4-CIN后延長(zhǎng)了小鼠的翻正反射恢復(fù)時(shí)間;麻醉覺(jué)醒時(shí)間明顯延長(zhǎng)提示星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸在促麻醉覺(jué)醒中發(fā)揮了重要作用。我們并未觀察到用FC抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體代謝、或化學(xué)遺傳學(xué)方法阻斷Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能對(duì)麻醉覺(jué)醒時(shí)間有顯著影響,這可能與這些技術(shù)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞部分功能影響的程度、給藥的劑量等因素有關(guān)。(3)本研究證實(shí)Pef區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持Orexin神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮了重要作用,其中星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸是介導(dǎo)這一效應(yīng)的關(guān)鍵因素。在促麻醉覺(jué)醒行為研究中,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞源性乳酸向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)運(yùn)后會(huì)導(dǎo)致麻醉覺(jué)醒時(shí)間的延長(zhǎng)。本研究的結(jié)果,為干預(yù)麻醉覺(jué)醒的新策略提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】:中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類(lèi)】:R614
【部分圖文】:

麻醉藥,星形膠質(zhì)細(xì)胞,突觸傳遞,突觸


圖 1.主要的麻醉藥及臨床首次運(yùn)用時(shí)間[1]星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元興奮性的調(diào)控人類(lèi)大腦由兩類(lèi)細(xì)胞組成:一類(lèi)是神經(jīng)元,另一類(lèi)是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。自 1846 年dolfVirchow 首次描述神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以來(lái),科學(xué)界對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞,尤其是星形膠質(zhì)細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能做了廣泛的研究。近期研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)、結(jié)構(gòu)支撐、神經(jīng)元興奮性及突觸傳遞的調(diào)控中均發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)元興奮性是神經(jīng)元活動(dòng)和信號(hào)傳遞的基礎(chǔ),依賴(lài)于神經(jīng)元本身的代謝活動(dòng)觸內(nèi)外興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的調(diào)控。研究表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠很伸出和縮回很細(xì)的突起,接觸或脫離動(dòng)態(tài)的樹(shù)狀突起和軸突終末[13]。在許多突,星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起將突觸前和突觸后神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)一起包裹起來(lái)形成聯(lián)突觸”結(jié)構(gòu)[14]。“三聯(lián)突觸”是星形膠質(zhì)細(xì)胞影響神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞構(gòu)基礎(chǔ)。目前觀點(diǎn)認(rèn)為,星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞的調(diào)控主要

示意圖,神經(jīng)元,細(xì)胞,示意圖


圖2.A為鉗制神經(jīng)元示意圖,B為自帶熒光的Orexin神經(jīng)元2)細(xì)胞鉗制:將拉制好的電極內(nèi)灌入約 1/3K+內(nèi)液,電極尖端阻抗為 4-8MΩ。用玻璃注極輕微的正壓以避免尖端被溶液中的雜質(zhì)干擾,利用微操儀移動(dòng)玻璃電液中,調(diào)整電極位置于屏幕中央,然后同時(shí)下調(diào)鏡頭與電極,使電極尖端胞表面正上方,將液接電位歸零。再次以 μm/sec 級(jí)速度下調(diào)玻璃電極,面出現(xiàn)凹陷,且顯示封接電阻增加了 0.1-0.2MΩ。此時(shí)撤去正壓,并使用抽吸細(xì)胞膜給予負(fù)壓,使封接電阻達(dá) 1GΩ,再將鉗制電壓鉗制逐漸調(diào)至,等待 1min 左右至基線平穩(wěn)后使用注射器短促負(fù)壓吸引破膜,破膜后可充放電反應(yīng),形成全細(xì)胞鉗制模式。3)神經(jīng)元靜息膜電位(RMP)及自發(fā)動(dòng)作電位(AP)的記錄:細(xì)胞破膜穩(wěn)定 3-5 分鐘后,轉(zhuǎn)換至電流鉗模式,正常灌流液灌流,記錄 更換含藥物(FC)的灌流液記錄 5min,再轉(zhuǎn)換至正常灌流液記錄 10min

神經(jīng)元,興奮性突觸,突觸傳遞


圖 4.FC 對(duì) Orexin 神經(jīng)元自發(fā)的興奮性突觸后電流(sEPSC)及抑制性突觸后電流(sIPSC)的影響。A)B)Orexin 神經(jīng)元鉗制到-70mV,阻斷 GABA 突觸傳遞,給予 FC 后 sEPSC 的頻率和幅值未發(fā)生明顯變化;C)D)Orexin 神經(jīng)元鉗制在+30mV,阻斷 NMDA/AMPA 突觸傳遞,給予 FC 后 sIPSC 的頻率和幅值無(wú)明顯變化;4.1.3 Orexin 神經(jīng)元的鑒定為確保統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)均為 Orexin 神經(jīng)元,我們記錄時(shí)在電極內(nèi)液中加入Biocytin,記錄后進(jìn)行 Orexin 神經(jīng)元、Biocytin 免疫熒光染色。如圖 5A 為 Orexin 神經(jīng)元,5B 為 Biocytin 標(biāo)記的神經(jīng)元,5C 表示兩者共定位。Scale bar=50μm

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4 記者 胡德榮;星形膠質(zhì)細(xì)胞由“天使”變“魔鬼”原因找到[N];健康報(bào);2012年

5 記者 劉海英;星形膠質(zhì)細(xì)胞可調(diào)節(jié)呼吸強(qiáng)度[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

6 吳一福;黃芪可調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞“時(shí)間模式”[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

7 汪敏華;大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞有兩種新功能[N];解放日?qǐng)?bào);2003年

8 南方日?qǐng)?bào)記者 曹斯 實(shí)習(xí)生 趙莞 張寧 通訊員 鄒瑩 張淼;用ATP對(duì)抗不快樂(lè)[N];南方日?qǐng)?bào);2013年

9 實(shí)習(xí)記者 王遠(yuǎn)白;八年真愛(ài)救活絕癥妻子[N];貴陽(yáng)日?qǐng)?bào);2010年

10 張?zhí)锟?干細(xì)胞研究精彩紛呈[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 肖一帆;損傷相關(guān)分子模式分子在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用[D];華中科技大學(xué);2018年

2 張業(yè)昊;SLT對(duì)缺血缺氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響及保護(hù)機(jī)制的研究[D];中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院;2018年

3 張?jiān)讫?帕金森病中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)變化機(jī)制及其調(diào)控策略[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王震;星形膠質(zhì)細(xì)胞CD59低表達(dá)參與視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性病灶的形成[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

5 王東披;早期激活星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ聚集誘導(dǎo)的病理變化的影響[D];浙江大學(xué);2016年

6 趙俊利;光遺傳學(xué)特異性調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞在皮層癲癇中的作用研究[D];浙江大學(xué);2018年

7 朱佳蕾;星形膠質(zhì)細(xì)胞Drd2-β-arrestin2信號(hào)通路對(duì)帕金森病神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

8 胡兆麗;星形膠質(zhì)細(xì)胞Kir6.1/K-ATP通道調(diào)節(jié)線粒體功能參與帕金森病的發(fā)生[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

9 孫亞玲;氯化鑭誘發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞乳酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和興奮性異常以及對(duì)神經(jīng)元的損傷作用研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

10 羅家明;小檗堿對(duì)EAE小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞SPHK1/S1P/S1PR1、3通路影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周孟春;HECTD1對(duì)脂多糖介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和遷移的作用[D];東南大學(xué);2018年

2 郭娟;下丘腦穹窿周區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞在吸入麻醉覺(jué)醒過(guò)程中的作用研究[D];中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

3 王娜;星形膠質(zhì)細(xì)胞TWIK-1通道調(diào)控海馬神經(jīng)元活動(dòng)的作用研究和機(jī)制初探[D];華中科技大學(xué);2018年

4 張利平;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中的作用[D];華北理工大學(xué);2018年

5 程雪軍;用大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層制備小鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的研究[D];杭州師范大學(xué);2018年

6 李娜;淫羊藿苷抗原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2018年

7 吳倩;從JAK2/STAT3信號(hào)通路研究參芪益智顆粒調(diào)控腦星形膠質(zhì)細(xì)胞抗AD作用機(jī)制[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2018年

8 陳嘉龍;meteorin蛋白在腦缺血模型中的表達(dá)和作用[D];南京大學(xué);2016年

9 何小亮;雷帕霉素對(duì)帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

10 張緩緩;星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控NGF/TrkA通路對(duì)精神障礙大鼠模型的神經(jīng)修復(fù)作用[D];蘇州大學(xué);2018年



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