【摘要】：研究目的 急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)本質(zhì)是過度失控的炎癥反應(yīng),眾多效應(yīng)細(xì)胞參與ARDS進(jìn)程,而中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)是最重要的效應(yīng)細(xì)胞。ARDS早期單核-巨噬細(xì)胞被激活,釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白介素-1β(interleukin-1, IL-1β)、IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子,這些因子可激活PMN和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞,使大量PMN在肺內(nèi)聚集,釋放髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、氧自由基及溶酶體酶等多種炎癥介質(zhì),導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的廣泛損傷。 核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子,通常狀態(tài)下,NF-κB以二聚體形式與核因子-κB抑制蛋白(inhibitor κB protein, IκB)結(jié)合形成NF-κB-IκB三聚體復(fù)合物,以非活性狀態(tài)存在于胞漿中。其中發(fā)揮主要生理功能的是NF-κB p50/p65二聚體,NF-κB p65為其主要亞單位。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌外膜主要成分,可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化,IκB解離,NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合后活化,高效誘導(dǎo)抗炎-促炎細(xì)胞因子、粘附分子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄。而TNF-α、 IL-1β也可激活NF-κB。IL-10是一種主要的抗炎細(xì)胞因子,對NF-κB的活化產(chǎn)生抑制作用,減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。 粘附分子家族中與PMN活化關(guān)系最為密切的是整合素CD11b/CD18。在趨化因子的作用下,CD11b/CD18在PMN表面表達(dá)增多,并與其配體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)相互作用,參與PMN及血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、跨越血管內(nèi)皮等病理生理過程。中性粒細(xì)胞趨化因子(cytokine induced neutrophil chemoattractant,CINC)是PMN特異性趨化因子,也是趨化因子IL-8家族的同源物。LPS、TNF-α及IL-1β的刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞釋放CINC,對PMN向肺內(nèi)募集起重要作用。另一種趨化因子內(nèi)皮中性粒細(xì)胞激活肽-78(epithelial neutrophil activating pep-tide-78, ENA-78)也可趨化PMN。此外,ENA-78與CDllb/CD18受體結(jié)合,會使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+增加,致肺毛細(xì)血管通透性增加。 吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)為一種抗氧化劑,是NF-κB的特異性抑制劑。PDTC通過穩(wěn)定抑制蛋白IκB、增加IκB的合成、阻止IκB的磷酸化和后續(xù)降解,抑制NF-κB激活,使細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子的表達(dá)減少,抑制PMN等炎性細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集。 本研究探討了小鼠ARDS時NF-κB活化、促炎-抗炎細(xì)胞因子表達(dá)與PMN肺內(nèi)聚集的關(guān)系；闡述肺組織粘附分子(CD11b/CD18、ICAM-1)及趨化因子(CINC、ENA-78)表達(dá)在PMN活化中的作用；研究PDTC對NF-κB的干預(yù)作用,為臨床治療ARDS提供新的思路。 研究方法 一、動物模型的建立及分組 腹腔內(nèi)注射LPS(20mg/kg)建立BALB/c小鼠ARDS模型,隨機(jī)分對照組(N組)、脂多糖組(L組)、PDTC干預(yù)組(P+L組)。于LPS注射前半小時腹腔內(nèi)注射PDTC (120mg/kg)來實現(xiàn)對小鼠ARDS的干預(yù)。NS組腹腔內(nèi)注射20ml/kg的生理鹽水。 二、標(biāo)本的采集 每組小鼠于造模后2h、6h、12h及24h腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg麻醉。因所測指標(biāo)無法一次取材成功,分三部分取材。第一部分：眼眶采血,取血清-80℃保存,備查細(xì)胞因子及總蛋白。隨后開胸,心尖采血行血氣分析；留取肺組織,取右肺以備HE染色和免疫組化染色；取左肺計算肺濕/干重比值(wet/dry weight ratio, W/D)。第二部分：收集支氣管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),離心,取上清液行細(xì)胞因子及總蛋白水平測定,收集細(xì)胞沉渣,行白細(xì)胞計數(shù)及測PMN比例。第三部分：取肺組織放入-80℃液氮中保存,備Western blot.逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR及髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性的檢測。 三、檢測方法及指標(biāo) 1、HE染色評估肺組織病理損傷及評分；測肺通透指數(shù)(lung permeability index, LPI=BALF中蛋白/血清蛋白)及W/D;測P(A-a)02。 2、取BALF細(xì)胞沉渣,行Wright-Giemsa染色,計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)及PMN的比例。 3、收集BALF上清液及取備用血清,ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-10的水平；應(yīng)用試劑盒檢測肺組織MPO活性。 4、提取肺組織總蛋白,Western blot法測定磷酸化NF-kB (phospho-nuclear fac-tor-kappa B, p-NF-κB)表達(dá)；提取胞漿及胞核蛋白,Western blot法測定胞漿及胞核NF-kBp65表達(dá)。 5、免疫組化法檢測肺組織NF-kB、粘附分子(CDllb/CD18. ICAM-1)及趨化因子ENA-78表達(dá)。 6、采用逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR (Real-time PCR)法測肺組織CINCmRNA表達(dá)強度。 7.、統(tǒng)計學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包分析。兩兩之間的比較采用t檢驗,P0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.01表明差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)果 一、一般情況 NS組小鼠呼吸平穩(wěn),解剖后肺部外觀色澤粉紅；L組小鼠呼吸急促,口唇發(fā)紺,解剖后肺體積增大,色澤暗紅或紫紅,臟層胸膜下點狀、片狀出血,切面淡紅色液體滲出；P+L組小鼠呼吸急促減輕,解剖后肺體積無明顯增大,色澤呈紅色,表面見少許散在的出血點,包膜張力減輕。 二、HE染色評估肺組織病理損傷及評分 1、HE染色 NS組肺組織結(jié)構(gòu)完整正常；L組部分肺泡壁不同程度的破壞或斷裂,肺微血管充血、出血、微血栓形成,肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞壞死；PDTC干預(yù)后肺組織損傷程度減輕。 2、肺病理評分 L組肺組織病理評分明顯高于NS組(P0.01)；PDTC干預(yù)后病理評分較L組下降(P0.05),病理評分與HE染色肺組織損傷的動態(tài)變化趨勢相似。 三、肺血管通透性變化的檢測 1、肺組織濕/干重比值(W/D) L組肺組織W/D值較NS組明顯增加(P0.01),隨著造模時間延長W/D值逐漸增加；PDTC干預(yù)后肺水腫程度減輕,W/D值均較LS組明顯下降(P0.05),但高于NS組。 2、肺通透指數(shù)(LPI) L組肺LPI較NS組明顯升高(P0.01),PDTC干預(yù)后肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)蛋白滲出減少,與L組對比,LPI下降(P0.05)。 四、BALF中白細(xì)胞總數(shù)及PMN比例 L組白細(xì)胞總數(shù)及PMN比例較NS組進(jìn)行性增加(P0.01)；PDTC干預(yù)后白細(xì)胞總數(shù)下降,各時相點均低于L組,2h及6h與L組對比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),12h及24h與L組對比,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；但P+L組各時相點PMN比例與L組對比呈下降趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 五、血清及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-10的表達(dá) L組血清及BALF中TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度明顯高于NS組(P0.01)；PDTC干預(yù)后TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度在2h、6h及12h低于L組(P0.05),而在24h明顯低于L組,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),但均高于NS組。 與NS組對比,L組在最初6h內(nèi)血清及BALF中IL-10的濃度升高(P0.05),隨著時間延長,IL-10的濃度明顯升高(P0.01)；PDTC干預(yù)后,與L組比較,2h IL-10的濃度略降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但6h、12h及24h IL-10的濃度低于L組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 六、肺組織中MPO的活性 L組肺組織MPO活性較NS組明顯增加(P0.01)；PDTC干預(yù)后與L組比較,MPO活性降低(P0.05),但不能回到正常水平。 七、Western blot檢測肺組織p-NF-κB、胞漿及胞核中NF-κBp65蛋白的表達(dá) L組肺組織p-NF-κB蛋白的表達(dá)增強,與NS組相比(P0.01)；PDTC干預(yù)后p-NF-κB蛋白的表達(dá)增強較L組降低(P0.05)。 L組肺組織胞漿中P65蛋白的表達(dá)強度降低,而胞核中P65蛋白表達(dá)強度升高,與NS組比較(P0.01)。PDTC干預(yù)后胞漿中P65蛋白的表達(dá)強度較L組升高(P0.05)；在2h、6h及12h而胞核中P65蛋白表達(dá)強度較L組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),在24h胞核中P65蛋白表達(dá)強度較L組明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 八、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR檢測CINCmRNA的表達(dá) NS組肺組織有極少量的CINCmRNA的表達(dá)；與NS組相比,L組CINCm RNA的表達(dá)明顯增加(P0.01)；PDTC干預(yù)后肺組織CINCmRNA的表達(dá)與L組對比表達(dá)明顯減少(P0.01)。 九、免疫組化檢測肺組織NF-κB、CD11b/CD18及ICAM-1、ENA-78的表達(dá) 以細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色或棕黃色著色為陽性表達(dá)。與NS組對比,L組可見較多的NF-κB陽性免疫反應(yīng)的細(xì)胞,主要表達(dá)在肺間質(zhì)PMN; PDTC干預(yù)后NF-κB陽性免疫反應(yīng)的細(xì)胞減少。L組CDllb/CD18陽性表達(dá)的細(xì)胞較NS組明顯增加,主要在PMN上表達(dá)；PDTC干預(yù)后CD11b/CD18陽性表達(dá)的細(xì)胞減少。ICAM-1主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞,與NS組對比,L組ICAM-1陽性免疫反應(yīng)的細(xì)胞增加；PDTC干預(yù)后ICAM-1陽性免疫反應(yīng)的細(xì)胞減少。與NS組對比,L組ENA-78陽性表達(dá)的細(xì)胞增加,以內(nèi)皮細(xì)胞陽性表達(dá)為主；PDTC干預(yù)后ENA-78陽性表達(dá)的細(xì)胞減少。 研究結(jié)論 1、LPS誘導(dǎo)的ARDS中,NF-κB磷酸化降解,NF-KBp65由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移,NF-κB激活,細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-a).粘附分子及趨化因子表達(dá)增加。 2、小鼠ARDS早期促炎-抗炎反應(yīng)失衡,表現(xiàn)在促炎細(xì)胞因子表達(dá)增多,抗炎細(xì)胞因子相對不足,且高表達(dá)時間滯后。 3、在趨化因子(CINC. ENA-78)的作用下,PMN表面粘附分子CD11b/CD18表達(dá)增多,與其配體內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子ICAM-1相互作用,使PMN粘附在血管壁,并跨越內(nèi)皮向肺組織浸潤。 4、PDTC通過抑制NF-κB的激活,下調(diào)細(xì)胞因子、粘附分子及趨化因子的表達(dá),減少PMN聚集,改善促炎-抗炎介質(zhì)的失衡,使PMN釋放的MPO減少,肺組織損傷減輕。 創(chuàng)新性及意義 1、本研究系統(tǒng)地從肺組織p-NF-κB及胞漿、胞核p65蛋白表達(dá)闡述ADRS時NF-κB活化。 2、探討粘附分子、趨化因子的高表達(dá)對ARDS肺組織PMN聚集的影響。 3、研究NF-κB的特異性抑制劑PDTC對ARDS小鼠的保護(hù)機(jī)制,為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制、拓展ARDS的治療途徑提供廣闊的前景。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R563.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭亞麗;黃宏;曾大雄;趙建平;方慧娟;Jean-pierre Lavoie;;InterInterleukin (IL)-4 Induces Production of Cytokine-induced Neutrophil Chemoattractants (CINCs) and Intercellular Adhesion Molecule (ICAM)-1 in Lungs of Asthmatic Rats[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年04期

2 Qiao-Ming Ning;Xiao-Ning Sun;Xin-Kai Zhao;;Role of mechanical stretching and lipopolysaccharide in early apoptosis and IL-8 of alveolar epithelial typeⅡcells A549[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2012年08期

本文編號：2804768