【摘要】：目的:隨著手術(shù)和診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步,胎兒手術(shù)日益增多,孕中期一直被視為孕期手術(shù)的安全時(shí)期。手術(shù)技術(shù)的不斷進(jìn)步和患者數(shù)量的增加,也對(duì)妊娠期麻醉提出了更高的要求。為了滿足胎兒開放手術(shù)的需要,使用吸入麻醉藥已經(jīng)成為宮內(nèi)手術(shù)首選的方法。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明常用的吸入麻醉藥物對(duì)發(fā)育期未成熟的大腦會(huì)造成認(rèn)知功能的損傷。盡管鎮(zhèn)靜或全身麻醉過程通常被認(rèn)為是安全的,但人們逐漸意識(shí)到,相對(duì)安全的手術(shù)期對(duì)于胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育不一定是安全的,因?yàn)樵兄衅谑巧窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,此時(shí)腦內(nèi)存在著廣泛的神經(jīng)發(fā)生。這一時(shí)期胎兒大腦容易受到外界環(huán)境因素的干擾,細(xì)微的改變都可能會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)的異常。作為胚胎神經(jīng)發(fā)育的重要時(shí)期,孕中期麻醉藥物暴露對(duì)子代腦發(fā)育的影響也逐漸受到關(guān)注,近幾年逐漸有嚙齒類動(dòng)物研究報(bào)道孕中期麻醉藥暴露干擾胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。課題組的前期工作中,將孕中期大鼠暴露于臨床上最常用的吸入麻醉藥七氟醚中,在2%和3.5%兩種不同濃度下分別麻醉2小時(shí),觀察子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶能力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),孕中期2小時(shí)3.5%七氟醚麻醉引起了神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的增多和增殖的抑制,并對(duì)子代大鼠產(chǎn)生空間學(xué)習(xí)記憶損害,而2%七氟醚麻醉的孕鼠子代沒有表現(xiàn)出凋亡與增殖的改變及學(xué)習(xí)記憶功能損傷。隨著對(duì)全身麻醉藥神經(jīng)毒性認(rèn)識(shí)的不斷深入,人們逐步發(fā)現(xiàn)麻醉藥物神經(jīng)毒性的相關(guān)機(jī)制,包括線粒體損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡紊亂等,而這些因素均可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬水平的提高。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種高度保守的自我降解過程,可以參與細(xì)胞內(nèi)多種生理或病理過程,例如營(yíng)養(yǎng)剝奪、應(yīng)激狀態(tài)、衰老或細(xì)胞內(nèi)感染等,自噬雖然可以清除有害蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器,但過度自噬會(huì)導(dǎo)致Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡。在易受環(huán)境影響的神經(jīng)發(fā)生時(shí)期,干擾細(xì)胞程序性死亡相關(guān)的過程,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育也會(huì)造成影響。除了維持細(xì)胞存活和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),自噬對(duì)正常的腦發(fā)育也是必要的。自噬參與了早期神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,包括細(xì)胞的分化和增殖。此外干擾正常的自噬水平,會(huì)影響神經(jīng)發(fā)生的過程,導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育的異常。作為細(xì)胞程序性死亡的兩種機(jī)制,自噬和凋亡存在著復(fù)雜的相互作用,在特定情況下,自噬促進(jìn)細(xì)胞存活,防止細(xì)胞凋亡;在其他情況下,自噬會(huì)與凋亡協(xié)同,加速細(xì)胞死亡。當(dāng)自噬過度活躍時(shí)會(huì)損傷細(xì)胞器,造成線粒體功能障礙,并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大量降解,無(wú)法維持細(xì)胞的基本功能,從而導(dǎo)細(xì)胞死亡。目前還沒有全身麻醉藥物對(duì)發(fā)育期腦的毒性作用中自噬與凋亡、增殖關(guān)系的報(bào)道,因此本研究將探討在七氟醚對(duì)孕中期胎鼠大腦的神經(jīng)毒性中自噬在凋亡、增殖中發(fā)揮的作用。作為一種腫瘤抑制基因,同源性磷酸酶張力蛋白(PTEN)與神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān),在人、鼠腦發(fā)育過程中普遍存在,是神經(jīng)發(fā)生和再生重要的內(nèi)在分子。PTEN抑制胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)磷酸化,從而阻斷Akt及其下游激酶的活性,Akt/mTOR作為負(fù)性自噬調(diào)節(jié)通路也已經(jīng)被普遍認(rèn)可。在乙醇使新生鼠神經(jīng)自噬增多的研究中發(fā)現(xiàn),乙醇可能是通過mTOR通路來(lái)調(diào)控自噬的活性,且急性酒精暴露可使磷酸化的Akt減少。因此本實(shí)驗(yàn)將探討七氟醚是否通過PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控自噬活性,且調(diào)控自噬水平后,觀察子代大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能是否會(huì)受到影響。研究方法:1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇Sprague Dawley(SD)大鼠,進(jìn)行大鼠合籠,對(duì)懷孕14天大鼠進(jìn)行麻醉藥物處理,吸入2小時(shí)2%或者3.5%濃度的七氟醚。麻醉結(jié)束2小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后檢測(cè)自噬相關(guān)的標(biāo)記物L(fēng)C3BⅡ、Beclin-1和p62的表達(dá),用電鏡觀察胎鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞中的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu),用免疫熒光法雙染LC3B和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin。2、在3.5%七氟醚麻醉1小時(shí)前,對(duì)孕14天母鼠腹腔注射3-MA,其余組注射等量空白溶劑,麻醉結(jié)束上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)后用Western blot法檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平,用TUNEL與Nestin雙染法檢測(cè)凋亡神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量。3、在3.5%七氟醚麻醉1小時(shí)前,對(duì)孕14天腹腔注射3-MA,其余組注射空白溶劑,麻醉結(jié)束上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)后用Western blot法和免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin表達(dá)水平,用Ki67熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖。4、不同濃度七氟醚麻醉結(jié)束上述4個(gè)時(shí)間點(diǎn)后,用Western blot法檢測(cè)各組PTEN/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá),使用PTEN抑制劑bpV后,Western blot法和免疫熒光雙染法檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)記物表達(dá),TUNEl法、免疫熒光及免疫組化法檢測(cè)凋亡和增殖指標(biāo)。5、應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和PTEN抑制劑bpV后用Morris水迷宮測(cè)試子代雄性大鼠遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶功能,并在水迷宮測(cè)試結(jié)束后用NeuN免疫組化染色計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元相對(duì)數(shù)量。結(jié)果:1、孕中期2小時(shí)3.5%七氟醚麻醉激活胎鼠腦內(nèi)自噬水平:自噬體形成相關(guān)蛋白LC3BⅡ和Beclin-1表達(dá)升高,自噬過程中降解蛋白p62表達(dá)降低;電鏡下觀察到3.5%七氟醚麻醉后胎鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞中出現(xiàn)雙層膜自噬體或自噬溶酶體特異性結(jié)構(gòu);3.5%七氟醚使Nestin陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)LC3B呈斑塊或點(diǎn)狀強(qiáng)綠色熒光,其他組呈彌散且較弱的綠色熒光。2、應(yīng)用自噬抑制劑3-MA減輕了3.5%七氟醚激活的自噬,減少了凋亡的神經(jīng)干細(xì)胞:與3.5%七氟醚麻醉組相比,使用3-MA后Bcl-2表達(dá)升高,TUNEL與Nestin雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少。3、應(yīng)用自噬抑制劑3-MA,緩解了神經(jīng)干細(xì)胞增殖抑制:使用3-MA后減輕了3.5%七氟醚麻醉后Nestin表達(dá)的減少及Ki67陽(yáng)性細(xì)胞率的降低。4、3.5%七氟醚通過PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路激活神經(jīng)干細(xì)胞自噬:3.5%七氟醚引起PTEN表達(dá)的增高,p-Akt/Akt和mTOR的降低;應(yīng)用了PTEN抑制劑bpV后,升高了p-Akt/Akt和mTOR的表達(dá),減輕了七氟醚激活的自噬,減少TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,減輕了3.5%七氟醚麻醉后Nestin表達(dá)和Ki67陽(yáng)性細(xì)胞率的降低。5、應(yīng)用了自噬抑制劑3-MA或者PTEN抑制劑bpV后,子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能及神經(jīng)發(fā)育均得到了改善:與3.5%七氟醚麻醉組子代相比,應(yīng)用了自噬抑制劑3-MA或者PTEN抑制劑bpV后再進(jìn)行3.5%七氟醚麻醉的大鼠子代逃避潛伏期縮短,穿越平臺(tái)次數(shù)增加,并且海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量增多。結(jié)論:孕中期2小時(shí)七氟醚麻醉對(duì)胎兒腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞自噬水平影響呈濃度依賴性,3.5%七氟醚升高胎兒神經(jīng)干細(xì)胞自噬水平,2%七氟醚對(duì)自噬水平?jīng)]有影響;抑制升高的自噬水平減輕了七氟醚麻醉引起的神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡增多、增殖抑制。3.5%七氟醚引起的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞自噬水平激活是由PTEN/Akt/mTOR通路介導(dǎo)的,抑制PTEN后,激活的自噬受到抑制,減輕了七氟醚麻醉引起的神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡增多、增殖抑制。抑制自噬或PTEN均可減輕孕中期3.5%七氟醚麻醉引起的子代空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷及神經(jīng)元數(shù)量減少。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R614
【圖文】：

圖 1.1 孕中期 2 小時(shí) 3.5%七氟醚暴露上調(diào)胎鼠腦組織自噬體形成相關(guān)蛋白的表達(dá)A：孕中期 2 小時(shí)不同濃度七氟醚麻醉后各組 LC3BII 和 Beclin-1 表達(dá)；B：LC3BⅡ表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：Beclin-1 表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。n=5；與 CON 組相比： P < 0.05， P < 0.01；與 2%SEV組相比，#P < 0.05，##P < 0.01。3.2 孕中期 2 小時(shí) 3.5%七氟醚暴露降低胎鼠腦組織 p62 表達(dá)我們檢測(cè)了自噬體形成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，但這還不足以完全判斷自噬流的水平。LC3BⅡ和 Beclin-1 表達(dá)增高有可能是由于自噬體形成的增多，或者自噬流降解功能的受損，從而導(dǎo)致自噬體形成蛋白的堆積。因此我們檢測(cè)了 p62 的表達(dá)水平，p62 在自噬體中特異性降解，其表達(dá)水平可以判斷自噬流是否通暢。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 3.5%七氟醚的作用下，p62 的表達(dá)水平與 2%七氟醚麻醉組和對(duì)照組相比均下降（圖 1.2，P 均<0.05）；2%七氟醚組與對(duì)照組間沒有差異。

圖 1.2 孕中期 2 小時(shí) 3.5%七氟醚暴露降低胎鼠腦組織 p62 表達(dá)A：孕中期 2 小時(shí)不同濃度七氟醚麻醉后各組 p62 表達(dá)；B：p62 表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。n=5；與CON 組相比： P < 0.05， P < 0.01， P < 0.001；與 2%SEV 組相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。3.3 孕中期 2 小時(shí) 3.5%七氟醚暴露引起胎鼠腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞自噬激活通過對(duì)關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)，結(jié)果顯示 3.5%七氟醚激活了胎鼠腦組織的自噬水平。我們對(duì) 3.5%七氟醚麻醉組胎鼠腦組織進(jìn)行了自噬的金標(biāo)準(zhǔn)——透射電鏡（TEM）掃描。透射電鏡掃描的結(jié)果顯示，在神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了雙層膜的圓形結(jié)構(gòu)，即自噬體（圖 1.3，A）和自噬溶酶體（圖 1.3，B），即孕中期 2小時(shí) 3.5%七氟醚麻醉后神經(jīng)干細(xì)胞中發(fā)生了自噬。

圖 1.3 孕中期 2 小時(shí) 3.5%七氟醚暴露引起胎鼠腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞自噬激活A(yù)：電鏡下觀察胎鼠腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)自噬體：黑色箭頭所示；B：電鏡下觀察胎鼠腦組織中神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體：黑色箭頭所示。標(biāo)尺：500 納米。除此之外，我們還對(duì) 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組進(jìn)行了 LC3B 和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin 免疫熒光雙染。結(jié)果顯示在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，對(duì)照組和 2%七氟醚麻醉組LC3B 熒光強(qiáng)度較弱，且呈細(xì)胞質(zhì)內(nèi)彌散狀分布（圖 1.4），但是 3.5%七氟醚麻醉組中，LC3B 在 Nestin 陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，且呈點(diǎn)狀或斑塊狀聚集（圖 1.4），說(shuō)明 3.5%七氟醚麻醉組的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生了自噬的激活。

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