【摘要】：鹵族吸入麻醉劑由于其高效率和易控制性在臨床實踐中被廣泛地使用。但多年來研究已經(jīng)認(rèn)識到異氟醚等吸入麻醉劑本身具有神經(jīng)毒性,誘發(fā)動物和人類神經(jīng)病理學(xué)改變。回顧性病例分析報道了手術(shù)和麻醉對認(rèn)知軌跡的潛在影響,證實異氟醚與學(xué)習(xí)記憶損傷,認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)潛在的有害風(fēng)險。因此,吸入麻醉劑誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機制研究對指導(dǎo)患者安全適用吸入全身麻醉劑具有重要意義。異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷與神經(jīng)元缺失、神經(jīng)元炎癥和神經(jīng)元異常蛋白聚集有關(guān),神經(jīng)元死亡、減少是公認(rèn)麻醉藥物致神經(jīng)毒性作用的主要因素。Ferroptosis是近年來提出的新概念,描述了一種依賴鐵代謝障礙的致命性脂質(zhì)過氧化引起的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式。Ferroptosis在形態(tài)學(xué),生物化學(xué),和遺傳學(xué)上不同于細(xì)胞凋亡,細(xì)胞自噬及其他形式的細(xì)胞壞死。研究表明Ferroptosis涉及多種病理生理狀態(tài),包括,急性組織損傷,腫瘤抑制,缺血/再灌注損傷,血色病,和神經(jīng)變性等病理過程。事實上,Ferroptosis,凋亡與自噬之間存在信號交叉,Erastin誘導(dǎo)ferroptosis水平在Beclinl沉默細(xì)胞中明顯被抑制。在某些條件下,Ferroptosis病變更可能是與細(xì)胞氧化應(yīng)激毒性相關(guān)的潛在機制。在神經(jīng)退行性疾病的背景下,神經(jīng)元中觀察到還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)活性降低,鐵超載和脂質(zhì)過氧化。異氟醚暴露后,離體腦組織及體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷明顯。因此,我們假設(shè)Ferroptosis可能參與異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷甚至神經(jīng)毒性作用。目前Ferroptosis與臨床應(yīng)用劑量下異氟醚誘細(xì)胞毒性反應(yīng)之間的作用關(guān)系及及可能的調(diào)節(jié)機制尚沒有研究報道。目的:本研究旨在了解異氟醚誘導(dǎo)細(xì)胞毒性損傷程度,同時探討Ferroptosis在異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷中的作用及可能的調(diào)控機制,補充異氟醚致神經(jīng)毒性的調(diào)節(jié)機制。方法:1)選用類神經(jīng)元細(xì)胞人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y為研究對象;2)Beclin1過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,建立Beclin1過表達(dá)和沉默的細(xì)胞模型;3)將細(xì)胞暴露于不同濃度異氟醚的密閉箱內(nèi)建立麻醉細(xì)胞模型;4)CCK-8(cell counting Kit-8)檢測細(xì)胞存活率;5)RT-qPCR(Rea1-time quantitative polymerase chain reaction)檢測 mRNA 表達(dá)水平變化;6)Western blot 檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化;7)免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)檢測蛋白質(zhì)間相互作用;8)免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測蛋白質(zhì)細(xì)胞定位;9)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,脂質(zhì)過氧化,和細(xì)胞內(nèi)螯合鐵水平變化;10)試劑盒檢測丙二醛(Malondialdehyde,MDA),GSH,和谷氨酸釋放變化。結(jié)果:1.多種損傷機制調(diào)節(jié)異氟醚誘導(dǎo)細(xì)胞損傷Microtubule-associated protein2(MAP2)是神經(jīng)元特異性細(xì)胞骨架蛋白,是神經(jīng)元表型的標(biāo)志物。SH-SY5Y細(xì)胞中MAP2的染色陽性,以證實SH-SY5Y細(xì)胞的一般神經(jīng)元特性。SH-SY5Y細(xì)胞暴露于不同濃度的異氟醚,CCK-8法檢測異氟醚暴露后的細(xì)胞存活率下降呈濃度依賴性(1.2%,2.4%,4.8%)和時間依賴性(6h,12h,24h,48h)。異氟醚(1.2%,2.4%,4.8%)處理 24h 后,流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡水平增加,與未處理對照組相比從3.63%分別增加到 7.75%,8.1%和 10.83%。Western blot 顯示 LC3-Ⅱ/-Ⅰ 比值增加 1.2,1.6 和1.9倍,p62蛋白水平分別下調(diào)至88%,75%,和59%。提示異氟醚暴露能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性包含多種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡過程。SH-SY5Y細(xì)胞分別與 Z-VAD-FKM,雷帕霉素,Necrostatin-1(Ner-1),Ferrostatin-1(Fer-1),Deferoxamine mesylate(DFOM)和異氟醚(1.2%或 2.4%)共培養(yǎng) 12h 或 24 h。五種抑制劑均改善了 1.2%異氟醚暴露引起的細(xì)胞活力的降低,并且五種藥物間對細(xì)胞活力的影響沒有顯著差異。而2.4%異氟醚培養(yǎng)24小時后,僅Fer-1和DFOM顯著抑制了細(xì)胞活力的降低。這些結(jié)果表明,抑制ferroptosis對于抑制較高濃度異氟醚誘導(dǎo)細(xì)胞活力下降更為有效。2.異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis異氟醚處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后,脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的表達(dá)水平以濃度依賴性(1.2%,2.4%)方式增加了 1.3倍和1.5倍,熒光探針從還原型(紅色)C11-BODIPY轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸?綠色)C11-BODIPY,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示氧化型C11-BODIPY從3.43%增加到23.8%和27.8%。熒光顯微鏡分析,異氟醚減弱了金屬指示劑Phen GreenTM SK的熒光量。流式細(xì)胞術(shù)分析熒光量從38.67%依次減弱到12.33%和7.67%。此外,異氟醚誘導(dǎo)24h后,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)GSH水平以濃度依賴性(1.2%,2.4%)顯著降低1.4倍和1.72倍。以上三種實驗表明SH-SY5Y細(xì)胞脂質(zhì)過氧化,鐵超載,和還原水平下降,提示異氟醚以濃度依賴性誘導(dǎo)ferroptosis。3.異氟醚對ferroptosis相關(guān)調(diào)節(jié)通路的影響異氟醚處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后,調(diào)節(jié)鐵轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的主要基因:鐵蛋白受體 1(transferrin receptor 1,TFRC),前列腺3 的六跨膜上皮抗原(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3,STEAP3),二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的mRNA和蛋白水平?jīng)]有明顯改變。RT-qPCR和western blot結(jié)果表明調(diào)節(jié)鐵輸出和儲存的膜蛋白鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin,FPNl)mRNA和蛋白水平水平同樣無明顯改變,提示鐵代謝相關(guān)途徑可能被動參與異氟醚誘導(dǎo)的ferroptosis。對于system Xc-/GSH/GPX4,異氟醚誘導(dǎo)后,RT-qPCR和western blot顯示人谷胱甘肽過氧化物酶4(Anti;-glutathione peroxidase 4,GPX4)的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平變化不明顯,但外源性補充GSH后,CCK-8檢測細(xì)胞存活率下降被顯著改善。推斷影響GSH活力變化的上游可能是異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis的關(guān)鍵過程。異氟醚誘導(dǎo)后,盡管RT-qPCR結(jié)果顯示system Xc-催化亞基溶質(zhì)載體家族7 成員 11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的 mRNA 水平上調(diào),但western blot檢測其蛋白質(zhì)水平?jīng)]有顯著變化。熒光定量檢測細(xì)胞外谷氨酸釋放水平以異氟醚濃度依賴性(1.2%,2.4%)降低,分別為對照組的80%及55%。這些結(jié)果表明,異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis可能與谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運障礙關(guān)系密切。4.異氟醚誘導(dǎo)Beclin1磷酸化并形成Beclin1-SLC7A11復(fù)合物異氟醚暴露后,western blot結(jié)果顯示ser93位點的Beclin1磷酸化水平呈濃度依賴性(1.2%,2.4%,4.8%)增高。SH-SY5Y細(xì)胞給予2.4%異氟醚誘導(dǎo)24 h后,免疫共沉淀結(jié)果顯示對照組中,IP:Beclin1,與其結(jié)合的SLC7A11水平極低,而異氟醚暴露后與Beclinl相互結(jié)合的SLC7A11水平顯著增高。反相驗證IP:SLC7A11得到相同結(jié)果。免疫熒光染色結(jié)果所示,Belin1與SLC7A11之間的共定位主要發(fā)生在SH-SY5Y細(xì)胞的胞質(zhì)中。以上結(jié)果提示異氟醚誘導(dǎo)Beclin1磷酸化并引起B(yǎng)elin1與SLC7A11發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用。5.過表達(dá)Beclin1增強異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis和細(xì)胞毒性。Beclin1-cDNA瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,建立Beclinl過表達(dá)的細(xì)胞模型。Western blot檢驗Beclinl表達(dá)量明顯增高2倍以上。2.4%異氟醚誘導(dǎo)24 h后,空載體對照組Bedinl-SLC7A11復(fù)合物增加3.8倍。過表達(dá)Beclin1后,異氟醚使二者結(jié)合水平進(jìn)一步增加至4.85倍。與空載體細(xì)胞對照,在Beclin1-cDNA細(xì)胞中,異氟醚誘導(dǎo)使谷氨酸釋放進(jìn)一步被抑制(0.58 vs 0.42),GSH活力進(jìn)一步被抑制(0.63 vs 0.43),MDA 水平進(jìn)一步增高(1.58 vs 2.02),氧化型 C11-BODIPY熒光量進(jìn)一步增高(24.34%vs 36.67%)。提示過表達(dá)Beclin1后,異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis敏感性增加�？蛰d體對照組給予異氟醚誘導(dǎo)24 h后,CCK-8檢測細(xì)胞存活率下降為62%。過表達(dá)Beclin1后,異氟醚使細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降為45%。提示過表達(dá)Beclin1加重了異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。6.抑制Beclin1抑制異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis和細(xì)胞毒性。Beclin1-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,建立Beclin1沉默的細(xì)胞模型。Western blot檢驗Beclin1表達(dá)量明顯降低,沉默效率60-70%。2.4%異氟醚誘導(dǎo)24h后,陰性對照組Beclin1-SLC7A11復(fù)合物增加3.02倍。過表達(dá)Beclin1后,異氟醚使二者結(jié)合水平明顯下降為1.13倍。同時,與空載體組對比Bedin1RNAi細(xì)胞中,異氟醚誘導(dǎo)使谷氨酸釋放被抑制得到改善(0.55 vs 0.85),GSH活力下降程度減弱(0.65 vs 0.87),增高的MDA水平得到下降(1.45 vs 1.19),增高的氧化型C11-BODIPY水平降低(25.67%vs 4.61%)。提示過抑制Beclin1后,異氟醚誘導(dǎo)ferroptosis敏感性下降。陰性對照組給予異氟醚誘導(dǎo)24 h后,CCK-8檢測細(xì)胞存活率下降為64.8%。在Beclin1RNAi細(xì)胞中,異氟醚暴露使細(xì)胞存活率下降得到改善(0.64 vs 0.77)。提示抑制Beclin1減弱了異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)論:1.異氟醚誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬等多種損傷調(diào)節(jié)機制中,鐵死亡可能發(fā)揮主要作用。2.異氟醚誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞ferroptosis呈濃度依賴性。3.異氟醚誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Beclinl磷酸化并形成Belin1-SLC7A11復(fù)合物。4.Beclin1通過調(diào)控system Xc-的活力影響異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞ferroptosis。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R614
【圖文】：

再灌注損傷，癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等在內(nèi)的許多病理狀況的具有獨特相關(guān)逡逑性，盡管這些研究尚處于起步階段［１１２＊１１３］。了解ｆｅｒｒｏｐｔｏｓｉｓ的分子機制和相關(guān)信逡逑號通路（圖１．１），為調(diào)節(jié)人類疾病中的細(xì)胞存活和死亡，提供新的可能的診斷和逡逑治療方法。逡逑Ｃｙｓｔｉｃ邋ａ邋Ｇｌｕｔａｍａｔ？逡逑_盡ⅲ幔徨�、逦濯辶x希ǎ停簦潁錚悖潁媯媯酰瑁蟈危苠澹校澹潁

本文編號：2788093