【摘要】：研究目的:椎間盤退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是臨床上的最常見的脊柱疾患,由于疾病治療費(fèi)用的增加,對現(xiàn)代社會造成了嚴(yán)重的財(cái)政負(fù)擔(dān),目前是椎間盤退行性疾病骨科常見病。多數(shù)人在一生中有下腰痛(low back pain,LBP)的癥狀,椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是造成下腰痛的最主要原因之一。目前,椎間盤退變的確切機(jī)制仍不明朗,治療方法仍局限于減輕癥狀而不是針對于解決該疾病的發(fā)病機(jī)制。隨著對椎間盤退變機(jī)制的不斷深入認(rèn)識,最新的治療應(yīng)著重在于阻斷介導(dǎo)椎間盤退變的生化和病理生理過程。目前得到共識的引起椎間盤退變的原因主要有:椎間盤本身的病變使椎間盤供血障礙,椎間盤局部缺血和組織壞死,導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生,進(jìn)而引起或加重椎間盤的退變;機(jī)械應(yīng)力促進(jìn)退變椎間盤釋放炎癥因子,椎間盤內(nèi)炎癥導(dǎo)致了椎間盤退變。所以,炎癥反應(yīng)及炎癥因子在脊柱退行性病變中起著舉足輕重的作用。引起椎間盤退變的主要炎癥因子有腫瘤壞死因子-α(TNF-α),它可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而影響椎間盤內(nèi)基質(zhì)的合成代謝過程,在椎間盤退變進(jìn)程中被認(rèn)為是主要的調(diào)控因素。另一重要炎癥因子是白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)。IL-1β主要在感染、創(chuàng)傷的刺激下產(chǎn)生,作用與TNF-α相似,它通過誘導(dǎo)蛋白聚糖的降解及阻礙椎間盤內(nèi)類軟骨樣細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)在椎間盤退變過程中起主導(dǎo)作用。此外,細(xì)胞培養(yǎng)研究也證實(shí)TNF-α能夠促進(jìn)IL-1βm RNA的產(chǎn)生。IL-1β具有增加分解代謝酶活性的作用。因此,生物治療可以通過抑制以TNF-α與IL-1β為主的炎癥因子表達(dá)從而進(jìn)一步改善細(xì)胞內(nèi)合成代謝過程及細(xì)胞增殖。白細(xì)胞介素-10(IL-10)能夠抑制炎癥因子的合成,具有很強(qiáng)的抑制TNF-α與IL-1β的作用。體外細(xì)胞經(jīng)IL-10治療后,90%的TNF-α被抑制,并且在IL-10表型缺陷的小鼠腸道內(nèi)發(fā)生了炎癥反應(yīng)充分證明了IL-10抑制炎癥反應(yīng)的重要作用。IL-10在限制炎癥因子的表達(dá)上起重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)促進(jìn)退變椎間盤細(xì)胞內(nèi)的增殖,并且通過對兔髓核細(xì)胞TGF-β進(jìn)行基因治療后,細(xì)胞內(nèi)蛋白多糖的表達(dá)量增加。在關(guān)節(jié)炎模型中,轉(zhuǎn)移質(zhì)粒DNA編碼TGF-β抑制炎癥反應(yīng)。而且在鼠巨噬細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞發(fā)現(xiàn),而且TGF-β還能夠上調(diào)IL-10合成路徑促進(jìn)IL-10的合成。盡管IL-10與TGF-β能夠抑制炎癥因子的合成,但能否用于椎間盤退變的生物治療尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本課題的研究目的是通過動物實(shí)驗(yàn),探索IL-10與TGF-β抑制TNF-α與IL-1β等炎癥因子與介質(zhì)的潛能,為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)。研究方法:本課題選1歲齡比格犬(重10-10.5kg)6只。所有比格犬均經(jīng)過脊柱X線篩查以排除骨贅形成,終板鈣化,許莫氏節(jié)結(jié),腰椎椎體的數(shù)量變化等異常。矢狀位MRT2加權(quán)像檢查排除術(shù)前存在椎間盤退變的犬。所有比格犬經(jīng)甲氧氟烷麻醉,眼瞼反射消失及手術(shù)區(qū)域針刺覺消失即視為麻醉完畢。麻醉完畢后10分鐘內(nèi)開始手術(shù),進(jìn)行比格犬椎間盤退變造模,手術(shù)切口為后外側(cè)L2-L5節(jié)段,16G針頭穿刺L2-3、L3-4、L4-5椎間盤纖維環(huán)。所有動物均在術(shù)后6周MRT2加權(quán)像出現(xiàn)椎間盤信號改變。當(dāng)MRI提示椎間盤信號改變,鹽酸氯胺酮及鹽酸賽拉嗪過量注射處死動物。無菌條件下取出L1-2、L2-3、L3-4、L4-5椎間盤髓核組織。L2-3、L3-4、L4-5髓核組織作為退變組,L1-2作為正常組。進(jìn)行髓核細(xì)胞分離,髓核組織剪碎至2-3mm直徑,0.2%鏈霉蛋白酶37°C消化60分鐘,再經(jīng)0.02%II型膠原酶消化過夜。加入胎牛血清培進(jìn)行培養(yǎng)。所有檢測均使用3代以內(nèi)的細(xì)胞。從L1-2分離得到2×107個(gè)細(xì)胞,L2-5分離得到6×107個(gè)細(xì)胞。將退變髓核組織獲得的細(xì)胞分為四組:1、未經(jīng)任何治療的退變細(xì)胞組;2、IL-10治療組(分別于6,12,24,48h加入20 ng/ml IL-10);3、TGF-β治療組(分別于6,12,24,48h加入20 ng/ml TGF-β);4、IL-10+TGF-β治療組(分別于6,12,24,48h加入20 ng/ml IL-10及20 ng/ml TGF-β);正常髓核細(xì)胞組作為陰性對照。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化計(jì)數(shù)后,按2×105細(xì)胞量重懸于Ep管中,加入TNF-α單克隆抗體進(jìn)Ep管,流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析平均熒光強(qiáng)度計(jì)算TNF-α的表達(dá)量;細(xì)胞經(jīng)12h,24h,48h治療后,分別收集每組上清液,ELASA試劑盒定量檢測IL-1β與TNF-α的表達(dá)量。另外收集各組細(xì)胞,提純出細(xì)胞總RNA:測RNA濃度,將RNA進(jìn)行發(fā)轉(zhuǎn)錄,生成c DNA,檢測Taq Man探針系統(tǒng)對IL-1β和TNF-α的m RNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。用stata12.0進(jìn)行單因素方差分析,每組之間的兩兩比較采用Bonferroni方法,檢測結(jié)果以X±SD表示,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)研究成功對比格犬相應(yīng)的椎間盤穿刺造模,所有動物均在術(shù)后6周MRT2加權(quán)像出現(xiàn)椎間盤信號改變。椎間盤退變模型建立后,手術(shù)成功取出各組需要的椎間盤髓核組織。成功提取髓核細(xì)胞,細(xì)胞的形態(tài)穩(wěn)定,增殖速度較快。流式細(xì)胞分析細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)量:分別于不同時(shí)間點(diǎn)對四組細(xì)胞數(shù)量及平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。治療后12h,IL-10治療組及IL-10+TGF-β治療組TNF-α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較未治療組明顯降低,TNF-α的表達(dá)也明顯降低(P0.01)。治療后24h,三個(gè)治療組TNF-α的表達(dá)量(平均熒光強(qiáng)度)較未治療組明顯降低(p0.01)。并且,IL-10+TGF-β治療組較IL-10治療組或TGF-β治療組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。TGF-β治療組與IL-10+TGF-β治療組TNF-α陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)在治療后48h達(dá)到最低水平,TNF-α的表達(dá)量(平均熒光強(qiáng)度)較未治療組明顯降低(p0.01);運(yùn)用ELISA試劑盒分別于12h,24h,48h檢測上清液中IL-1β和TNF-α的表達(dá)量。正常組,IL-10+TGF-β治療組TNF-α和IL-1β的表達(dá)量明顯降低。IL-1β的表達(dá)量在治療后24h達(dá)到最低,而在48h有所增加。與未治療組相比,IL-10+TGF-β治療組TNF-α和IL-1β的表達(dá)量在24h和48h明顯降低(p0.01);Real-time PCR結(jié)果顯示:IL-10和TGF-β治療能抑制IL-1β和TNF-αm RNA的表達(dá)。經(jīng)TGF-β治療后,IL-1β和TNF-αm RNA的表達(dá)量從6h至24h逐漸遞減。與未治療組相比,TGF-β治療組IL-1β和TNF-αm RNA的表達(dá)量在治療后12h與24h明顯降低(p0.01)。與此相反,在IL-10+TGF-β治療組或IL-10治療組,IL-1β和TNF-α的表達(dá)量在治療后6h迅速降低并且持續(xù)到24h。與未治療組相比,正常組、TGF-β治療組IL-1β和TNF-αm RNA的表達(dá)量在治療后6h,12h,24h均明顯降低(p0.01)。結(jié)論:椎間盤穿刺造模方法能造成比格犬椎間盤退變,為生物學(xué)治療退變椎間盤能建立良好的模型。椎間盤退變引起的炎癥反應(yīng)同時(shí)能夠誘導(dǎo)上調(diào)多種炎癥因子的表達(dá)。本博士課題證實(shí)應(yīng)用TGF-β或IL-10能夠抑制炎癥因子的表達(dá)的同時(shí),也顯示二者聯(lián)合應(yīng)用作用較二者單獨(dú)應(yīng)用作用更強(qiáng)。IL-10與TGF-β能夠穩(wěn)定持續(xù)抑制TNF-α與IL-1β的產(chǎn)生,IL-10與TGF-β通過抑制退變椎間盤髓核細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì),可能會延緩椎間盤退變的進(jìn)程。另外,TGF-β與IL-10存在相似的抗炎特性,IL-10與TGF-β阻礙退變椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng),這會限制炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步擴(kuò)散。IL-10與TGF-β在椎間盤退變的生物治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53


本文編號：2776685