發(fā)布時間：2020-07-18 15:06

【摘要】：目的慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的一個重要病理特征是系統(tǒng)炎癥反應(yīng)(systemic inflammation),表現(xiàn)為循環(huán)血中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白介素(interleukin,IL)等炎性因子持續(xù)增多。這種炎癥反應(yīng)的來源廣泛,包括心臟自身,也包括肝、肺、血管內(nèi)皮、循環(huán)血中的白細胞等。就心臟而言,其中任何類型的細胞均可能作為炎癥反應(yīng)的來源。有研究表明,浸潤心肌的白細胞以及心臟自身的成纖維細胞是心臟炎癥反應(yīng)的來源,而心肌細胞在CHF炎癥反應(yīng)中的作用及機制尚不明確。文獻資料以及我們課題組的前期工作表明,心肌細胞可表達特定類型的免疫受體,例如toll樣受體(toll-like receptors,TLR),這些免疫受體具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的特性,如果被激活,則很可能使心肌細胞成為“炎性細胞”。有資料表明,心衰心臟中TLR4表達升高,但是沒有明確心肌細胞TLR4表達是否升高;再者,CHF心肌細胞TLR4的功能狀態(tài)如何尚未見研究,其是否具有不同于正常心肌細胞TLR4的致炎效應(yīng)仍屬未知。為了揭示CHF心臟中的心肌細胞是否扮演“炎性細胞”角色,并探討該“炎性”角色是否源于其中TLR4的表達量和致炎效應(yīng)增強,本課題利用大鼠心肌梗塞所致CHF模型,研究TLR4在心梗后CHF心肌細胞中的表達水平、與配體的結(jié)合能力以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力,以明確心肌細胞TLR4是否促進CHF心臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。方法雄性成年SD大鼠45只,全麻下開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支,造成心肌梗塞(myocardial infarction,MI);假手術(shù)動物經(jīng)受相同手術(shù)過程,但不作結(jié)扎。心梗后4周,行心臟超聲檢測,確認心功能障礙,即表明CHF。將心梗后CHF大鼠過量麻醉致死,進行以下檢測:(1)取血清,ELISA法測定BNP。(2)取缺血區(qū)和遠端區(qū)心肌,分別用real time RT PCR和Western blot法測定心肌組織TLR4 m RNA和蛋白含量。(3)用多聚甲醛固定心臟,按常規(guī)行石蠟包埋和切片,用免疫組化法檢測心肌細胞TLR4的分布和表達水平。(4)取心臟,用Langendorff裝置經(jīng)主動脈逆行灌流II型膠原酶,消化分離并收集心肌細胞。用real time RT PCR法測定心肌細胞TLR4以及炎癥因子IL 6和TNF α的m RNA含量,用Western blot法測定蛋白含量;用ELISA法測定炎癥因子IL 6和TNF α的蛋白含量;用免疫熒光細胞化學(xué)法檢測心肌細胞TLR4的分布和含量;用帶有熒光分子標記的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)配體LPS(lipopolysaccharide)和損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)配體HSP60(heat shock protein 60k D)分別與心肌細胞共孵育,以結(jié)合并激活心肌細胞內(nèi)的TLR4,通過結(jié)合的熒光強度分析心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體的親和力,并通過炎癥因子表達和釋放量分析心肌細胞TLR4的致炎效應(yīng)。結(jié)果1.心梗后CHF大鼠模型的建立在心梗后4w,心超測得CHF組左心室舒張末和收縮末內(nèi)徑均顯著大于假手術(shù)組,左心室縮短分數(shù)均低于20%(平均15.6±4.2%),且左心室前壁運動明顯減弱、部分動物左心室后壁運動也減弱;血清BNP檢測顯示CHF組BNP顯著高于假手術(shù)組;心肌切片HE染色顯示CHF心腔明顯擴大,缺血梗死區(qū)見大量炎性細胞浸潤。上述結(jié)果表明心梗后4w動物發(fā)生了CHF。2.心梗后CHF大鼠發(fā)生了心臟炎癥反應(yīng)及全身炎癥反應(yīng)在心梗后CHF大鼠心臟,缺血梗死區(qū)及遠端區(qū)炎癥因子TNFa和IL-6的m RNA和蛋白表達量均顯著升高;CHF組血清TNFa和IL-6蛋白含量顯著高于假手術(shù)組;在急性消化分離的心肌細胞,CHF組心肌細胞TNFa和IL-6的m RNA和蛋白表達量均顯著高于假手術(shù)組。以上三項結(jié)果表明,心梗后CHF大鼠發(fā)生了心臟炎癥反應(yīng)及全身炎癥反應(yīng)。3.在心梗后CHF狀態(tài)下,心肌細胞TLR4的m RNA及蛋白表達量均增加(1)在心梗后CHF心臟,缺血梗死區(qū)及遠端區(qū)TLR4的m RNA和蛋白表達量均顯著升高;免疫熒光組織化學(xué)顯示假手術(shù)心肌TLR4陽性信號呈斑片狀分布,而CHF心肌TLR4陽性信號分布更廣泛、且強度更高,主要分布于梗死周邊區(qū)和遠端區(qū)的心肌細胞,浸潤心肌的白細胞則基本檢測不到TLR4陽性信號。(2)從CHF心臟急性消化分離心肌細胞,免疫熒光細胞化學(xué)顯示TLR4陽性信號增強,該陽性信號主要分布于細胞膜,而胞漿內(nèi)分布相對較少且不均一。(3)從CHF心臟急性消化分離心肌細胞,其TLR4的m RNA和蛋白含量均顯著高于假手術(shù)組心肌細胞。以上結(jié)果表明,CHF心肌細胞TLR4的表達量上調(diào)。4.CHF心肌細胞的TLR4與PAMP和DAMP配體分子的最大結(jié)合能力增強從心梗后CHF心臟消化分離出心肌細胞,與TLR4特異性PAMP配體LPS或者DAMP配體HSP60共孵育(LPS和HSP60均帶有熒光探針標記),在激光共聚焦顯微鏡下觀察到CHF心肌細胞與LPS和HSP60的結(jié)合熒光均增強,且anti-TLR4抗體預(yù)處理顯著減少LPS和HSP60與心肌細胞的結(jié)合。依據(jù)熒光強度值擬合的結(jié)合曲線顯示,CHF心肌細胞TLR4與LPS和HSP60的最大結(jié)合能力(maximum binding capacity,Bmax)均增加,而解離常數(shù)(dissociation constant,Kd)則沒有明顯改變;此外,結(jié)合曲線也顯示anti-TLR4抗體預(yù)處理使得LPS和HSP60與心肌細胞的結(jié)合量顯著下降。上述結(jié)果表明,CHF心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體分子的最大結(jié)合能力增強。5.CHF心肌細胞的TLR4具有致炎效應(yīng)從心梗后CHF心臟消化分離出心肌細胞,分別給予TLR4特異性PAMP配體LPS或者DAMP配體HSP60進行刺激,檢測到大量炎癥因子被誘導(dǎo)產(chǎn)生,TNFa和IL-6表達和釋放量均顯著高于假手術(shù)組心肌細胞;用TLR4抗體封閉后,LPS和HSP60誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子大幅減少。該結(jié)果表明,CHF心肌細胞TLR4促進心肌炎癥反應(yīng)。結(jié)論本研究結(jié)果顯示:心梗后CHF心臟的心肌細胞TLR4表達上調(diào),心肌細胞TLR4與PAMP和DAMP配體的結(jié)合能力增強,促炎作用也增強。該結(jié)果表明,心肌細胞TLR4受體表達和功能上調(diào)是CHF心臟炎癥反應(yīng)的重要來源。心肌細胞不同于免疫細胞,通常不被認為具有致炎效應(yīng),本工作表明,心肌細胞在CHF狀態(tài)下可成為“炎性細胞”,在心肌細胞表達的TLR4受體可參與誘導(dǎo)心肌炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2;R541.6
【圖文】：

29炎癥反應(yīng)。(A)心肌梗死區(qū)和遠端區(qū)的 TNFα 和 I區(qū)的 TNFα 和 IL-6 蛋白水平。 (C) sham 和 CH(D)分離的 sham 和 CHF 大鼠心肌細胞中 TNFα 和 CHF 大鼠心肌細胞中 TNFα 和 IL-6 蛋白含量�？招腶ta are means ± SD. n = 4~6/group. *P < 0.05,

32D圖3 慢性心衰大鼠心肌TLR4的表達增加 (A) sham和CHF大鼠心肌缺血區(qū)和遠端區(qū)TLR4mRNA 水平(n = 6/group)。(B)代表性的 western blot 圖像和(C) sham 和 CHF 大鼠心肌缺血區(qū)和遠端區(qū) TLR4 蛋白定量(n = 4/group)。(D)代表性的心臟切片 TLR4 (green) 和CD45 (red)免疫組織化學(xué)染色圖。黃色的方框表示右側(cè)被放大的區(qū)域。(Data are means± SD. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. respective sham.)Asham CHF infarct CHF remote 1

圖 5 CHF 心肌細胞中 TLR4 與 LPS 和 HSP60 的結(jié)合能力增強。分離的心肌細胞在 37°C的 CO2孵箱中孵育 24h 后，在 4°C 孵育使其結(jié)合反應(yīng) 30min。培養(yǎng)的心肌細胞用 TLR4中和抗體 (anti-TLR4, 5 μg/ml) 在 37°C 孵育 15min 以封閉 TLR4，接著在 4°C 孵育FITC-LPS 或 OG-HSP60 30min。(A)分離的細胞孵育 FITC-LPS (green) 或 OG-HSP60(green)后的代表的熒光圖像。(B)FITC-LPS 與心肌細胞的結(jié)合曲線。(C)OG-HSP60 與心肌細胞的結(jié)合曲線。

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本文編號：2761054