本文關(guān)鍵詞：激光共聚焦內(nèi)鏡結(jié)合熒光標記的脂肪酸特異檢測大腸癌，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景代謝是生物體內(nèi)發(fā)生的用于維持細胞生長、增殖和分化等生命活動的反應進程。多數(shù)腫瘤的代謝與正常細胞存在很大差異,正常細胞依賴葡萄糖有氧氧化、脂肪酸β氧化供能,而在腫瘤中,即使氧氣供給充足,腫瘤細胞很少進行葡萄糖有氧氧化過程,反之,其對外界葡萄糖的吸收大大增加且產(chǎn)生大量乳酸,這種以糖酵解為主的代謝方式也稱為"Warburg效應”。在腫瘤細胞中,糖酵解代謝的產(chǎn)物丙酮酸并非進入三羧酸循環(huán)氧化,而主要參與合成代謝包括脂肪酸、核酸、蛋白質(zhì)等合成。脂肪酸是機體許多器官的重要能量來源,可由食物供給和內(nèi)源性的合成產(chǎn)生,脂肪酸合成(FASN)增加被稱為腫瘤代謝的另一重要標志,其與糖酵解過程密切相關(guān)。腫瘤細胞的脂肪酸代謝途徑異常,正常情況下,細胞吸收外源性的脂肪酸并將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯,以提供機體的能量儲備。然而,在腫瘤細胞中,即便外源性脂肪酸供給充足,腫瘤細胞極少利用其進行甘油三酯的儲備,而主要依靠糖酵解產(chǎn)物丙酮酸進行內(nèi)源性的脂肪酸合成,腫瘤中的酯化脂肪酸均由內(nèi)源性脂肪酸合成途徑產(chǎn)生,超過93%的甘油三酯由此途徑合成。這種正常和腫瘤細胞中脂肪酸的代謝差異揭示了兩者在外源性脂肪酸吸收及內(nèi)部脂肪酸利用的差異。結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤,在全球女性癌癥相關(guān)死亡率中位居第三,男性中位居第四,2008年全球因結(jié)腸癌死亡人數(shù)為608,700,過去認為主要由基因突變所致,近年來,隨著環(huán)境改變和人們不均衡的膳食模式等原因,其發(fā)病率不斷增長,已成為我國發(fā)病率升高最快的惡性腫瘤之一。腫瘤治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn),如果能在腫瘤發(fā)展早期作出相應的判斷和檢測,50%以上的惡性腫瘤可以治愈,5年生存率可達80-90%。結(jié)腸癌早期因其組織的結(jié)構(gòu)和功能未出現(xiàn)明顯變化,診斷僅依賴臨床醫(yī)師的經(jīng)驗和腫瘤宏觀形態(tài)學、血清腫瘤標志物、影像學、病理學等手段,敏感度和特異度較低。內(nèi)鏡被認為是結(jié)腸癌早期診斷最有效的方式。普通內(nèi)鏡對早期胃腸癌的診斷率低,新興的內(nèi)鏡如染色內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、超聲內(nèi)鏡等明顯提高了早期胃腸道腫瘤的檢出率。染色內(nèi)鏡能對黏膜細微結(jié)構(gòu)進行觀察,可根據(jù)黏膜及黏膜下血管紋理判斷病變的性質(zhì),對于扁平病變有較好的診斷,目前已運用到全消化道黏膜表層的檢查。放大內(nèi)鏡通過在病變表面噴灑0.3%Lugol碘液或0.4%靛胭脂染色后對組織局部放大10-100倍,較清晰的顯示腺管開口形態(tài),可在行內(nèi)鏡檢查的同時判斷病變是否行內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)(EMR),對早癌的診斷優(yōu)勢明顯。超聲內(nèi)鏡將內(nèi)鏡和超聲波結(jié)合于一體,行內(nèi)鏡檢查同時,使用超聲對待觀察部位進行定點探測,可知病變侵潤的深度、血管累及情況及與周圍臟器的關(guān)系。其在胰腺癌的診斷、胰腺假性囊腫穿刺治療方面有著其他內(nèi)鏡不可比擬的優(yōu)勢。激光共聚焦內(nèi)鏡(CLE)是一種新型的內(nèi)鏡技術(shù),它是傳統(tǒng)電子內(nèi)鏡和激光共聚焦顯微鏡整合的產(chǎn)物,在內(nèi)鏡檢查同時,還能進行共聚焦顯微鏡檢查,通過放大掃描檢查的組織1000倍,對細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)進行觀察,被稱為“光學顯微鏡”。共聚焦內(nèi)鏡成像主要依靠熒光對比劑的存在,運用較多的為熒光素鈉和鹽酸吖啶黃,熒光素鈉是一種廉價、無致突變性的對比劑,靜脈注射熒光素鈉數(shù)十秒后,共聚焦內(nèi)鏡下即可清晰顯示細胞輪廓和排列方式,其成像范圍可從上皮表面深入至固有層,然而熒光素鈉并不富集于細胞核,不易觀察到細胞核形態(tài),對病變的良惡性判別構(gòu)成很大干擾,且其可引起不良反應如過敏反應、惡心、嘔吐、眩暈等。鹽酸吖啶黃是通過局部噴灑對胃腸道黏膜進行染色,其可以穿過細胞膜與細胞核的酸性物質(zhì)結(jié)合,因此可以清晰顯示細胞核,但其成像范圍局限于粘膜表面,不能行粘膜層以下的對比檢查,且尤為重要的是鹽酸吖啶黃有輕微的致突變作用,臨床上應謹慎使用�；诠簿劢箖�(nèi)鏡巨大的使用價值,國內(nèi)外研究報道了許多新型的熒光對比劑,如熒光標記抗體(CD31、 VEGF、EGFR)、熒光標記的縮氨酸、代謝相關(guān)的熒光探針等。熒光基團標記的脂肪酸BODIPY-FA(C22H31BF2N2O2)是天然脂肪酸的類似物,其分子量為404,具有親脂性,激發(fā)/發(fā)射波長為500/510nm能被488nm的氬離子激光器激活,目前主要運用在脂肪酸轉(zhuǎn)運的研究中,可于流式細胞儀及共聚焦顯微鏡下觀察。研究目的在共聚焦內(nèi)鏡下,于不同腸癌模型的小鼠腸道局部給予BODIPY-FA染色,分析不同病變性質(zhì)的組織對BODIPY-FA的吸收情況,比較不同染色劑對于腫瘤診斷的效能,同時探討腸癌中脂肪酸吸收減少的相關(guān)機制。研究方法1、流式細胞儀檢鋇BODIPY-FA在腸癌細胞株中的吸收曲線及其與硬脂酸的吸競爭抑制作用(1)將不同的結(jié)腸癌細胞株以相同密度600,000個/孔培養(yǎng)于六孔板中,分別加入1ml的luM BODIPY-FA工作液,恒溫箱內(nèi)放置10秒,30秒,1分鐘,2分鐘,5分鐘,10分鐘6個時間點,吸去BODIPY-FA,0度冰PBS終止反應并清洗,經(jīng)消化、離心后,流式細胞儀檢測各時間點不同細胞對BODIPY-FA的熒光吸收值。(2)將不同的結(jié)腸癌細胞株以相同密度600,000個/孔培養(yǎng)于六孔板中,用luM的BODIPY-FA工作液和濃度分別為0.15uM、1.5uM的硬脂酸混合液等體積混合,分別加入1ml上述不同混合液,無硬脂酸的為對照組,恒溫箱中放置10分鐘,0度冰PBS終止反應并清洗,經(jīng)消化、離心后,流式細胞儀檢測各實驗組BODIPY-FA的熒光吸收值。2、構(gòu)建動物模型(1) AOM/DSS化學誘導結(jié)腸癌模型選取年齡為6周的Balb/c雄鼠,腹腔注射AOM12.5mg/kg后,正常飲水7天,于第2周予3%DSS連續(xù)7天,然后正常飲水連續(xù)14天,此為一個循環(huán),即連續(xù)給予3%DSS 7天,而后休息14天,總共三個循環(huán)。最后一個循環(huán)結(jié)束建模完成,不再給予DSS,我們前期的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：癌變的腸段(多靠近直腸)可出現(xiàn)肉眼可見的腸壁增厚、僵硬,能較好的提示腫瘤所在位置并進行染色處理。分批次提取老鼠,可直接處死小鼠進行組織染色的觀察和切片,也可進行后續(xù)的活體實驗。(2) APCmin小、鼠年齡為6-7周的APC-min雄鼠購自南京大學模式動物中心,為自發(fā)的腸道腺瘤模型,購買6-8周雌鼠與之交配,待繁殖數(shù)量較多的小鼠并DNA鑒定后,可直接處死小鼠進行組織染色的觀察和切片,也可進行后續(xù)的活體實驗。(3)裸鼠腸道移植瘤模型選取年齡為6周的Balb/c裸鼠。取處于對數(shù)期生長期的腸癌細胞株LOVO大批量傳代,經(jīng)消化、計數(shù)、離心后,棄上清收集細胞沉淀。在嚴格無菌條件下,以外科手術(shù)方式,用29g的微型注射器將細胞沉淀(每次細胞個數(shù)約106)注射入結(jié)腸漿膜層,注射成功的漿膜層可見局部圓形白色的隆起,有時可沿管壁呈縱形。關(guān)閉腹腔,表面消毒。約3-4周后移植的LOVO可突破肌層到達粘膜下層甚至粘膜層。3、動物實驗(實驗過程避光進行)(1)將腸癌模型的小鼠禁食12小時,以保證腸道清潔,用戊巴比妥0.01g/ml,劑量為6-7ul/g小鼠體重,腹腔注射麻醉,采用外科手術(shù)方式暴露腹腔,間斷分離2段長約1cm的結(jié)腸,以手術(shù)縫線結(jié)扎腸段兩端,結(jié)扎程度松緊適宜,以熒光染料不能通過結(jié)扎口,又不影響腸管血運為佳。用注射器吸取100u1的染色劑注射入結(jié)扎好的腸段內(nèi),小鼠分3組,染色劑分別為200uMBODIPY-FA、0.02%吖啶黃、500uM 2-NBDG。10分鐘后拆除縫線并沖洗,可將染色部分的腸管剪取行快速冰凍切片,也可運用共聚焦內(nèi)鏡在體觀察。(2)將共聚焦內(nèi)鏡的激光能量和亮度固定,于上述小鼠熒光劑局部染色10分鐘后,將染色部位沖洗干凈,共聚焦內(nèi)鏡探頭與腸粘膜層緊密接觸,每個部位觀察時間不超過20秒。內(nèi)鏡醫(yī)師根據(jù)共聚焦成像判斷探測部位的性質(zhì),實驗者用29g注射器(吸取印度墨汁)準確標記經(jīng)內(nèi)鏡醫(yī)師判斷過的病變部位。標號后的組織冰凍切片,HE金標準結(jié)果和共聚焦內(nèi)鏡診斷一一對應。4、組織化學法將小鼠活體染色后的組織包埋、速凍后,快速冰凍切片,厚度為5um,輪流貼片(一半用于HE染色,一半用于熒光染色),置于室溫避光干燥10-20分鐘。HE染色的切片經(jīng)蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色、梯度脫水后,中性樹膠封片。熒光染色的切片在組織上滴染核染料DAPI,8-10分鐘后室溫干燥,抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察、拍片。5、熒光定量PCR提取組織的RNA并檢測濃度,用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒兩步法完成cDNA合成,第一步：反轉(zhuǎn)錄反應37℃ 15min；第二步：反轉(zhuǎn)錄酶失活85℃ 5s。使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq試劑盒和LC480 System熒光定量PCR擴增儀進行熒光定量PCR檢測。6、Western blotting提取細胞蛋白,用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。經(jīng)電泳、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉,一抗孵育4℃過夜,一抗稀釋比例分別為CD36(1:400)、Caveolin-1(1:500)、GAPDH(1:3000),而后二抗(1：2500)孵育1小時,ECL化學發(fā)光法顯影。7、免疫組織化學收集南方醫(yī)院25例結(jié)直腸癌手術(shù)患者配對標本(正常和腫瘤共50),組織經(jīng)常規(guī)固定、包埋、切片、脫蠟、水化后,以0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)95度高溫抗原修復10分鐘,使用超敏SP試劑盒阻斷、封閉,一抗稀釋濃度為Caveolin-11:100、CD36 1:100,一抗孵育4℃冰箱過夜,然后DAB顯色劑顯色,蘇木素復染、返藍,常規(guī)脫水、透明及封片后,于顯微鏡下觀察。8、分析及統(tǒng)計方法熒光顯微鏡下組織的平均熒光強度使用Image-Pro Plus 6.0統(tǒng)計軟件,共聚焦圖片的灰度值使用Image J軟件,共聚焦圖片選取分析面積為60x60um,同一病變性質(zhì)的區(qū)域選取3個取其平均值,所有數(shù)值為平均值士標準誤。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism (v5.00)統(tǒng)計軟件,兩組間比較用兩獨立樣本t檢驗,多組組間比較用單因素方差分析。P值0.05具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果1、BODIPY-FA在腸癌細胞內(nèi)的吸收及與硬脂酸競爭情況不同細胞株對BODIPY-FA的吸收存在差異,SW480對BODIPY-FA的吸收量最多,而LOVO和HCT116對其吸收相對較少。在10分鐘內(nèi),SW480、 LOVO、HCT116細胞吸收BODIPY-FA呈不斷增長曲線提示其在細胞內(nèi)不斷蓄積,而HT29在10分鐘可見下降趨勢。此實驗探索了貼壁細胞對BODIPY-FA染色的最佳時間,為后續(xù)的動物在體染色實驗提供參照。在BODIPY-FA與硬脂酸(C18：0)的吸收競爭實驗中,濃度為0.15uM和1.5uM的硬脂酸能不同程度的抑制細胞對BODIPY-FA的吸收,這種抑制效應在SW480中最為顯著。實驗證明BODIPY-FA與硬脂酸共同競爭細胞膜上的脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白,其為脂肪酸的類似物,可作為游離脂肪酸的替代物進行生物體內(nèi)代謝情況的研究。2、Caveolin-1和CD36在人結(jié)腸癌組織中表達降低熒光定量PCR檢測配對的人結(jié)腸癌患者正常和腫瘤組織中mR NA的表達。CD36mRNA在腫瘤組織中表達量顯著低于正常黏膜,(腫瘤：0.003643±0.0006902,正常：0.07623±0.01995,P0.005)。caveolin-1 mRNA在腸癌組織中表達量較正常組織降低(腫瘤：0.1031±0.04203,正常：0.4381±0.1129,P0.005)。余FABPpm、FATP4mRNA在腫瘤和正常組織中表達無明顯差異。通過Western blotting檢測配對標本中Caveolin-1和CD36的蛋白表達量。86%的腫瘤組織Caveolin-1蛋白低表達,其平均表達量較正常組織減少約1.6倍。CD36在腫瘤組織中表達明顯減少,約為正常黏膜的1/2甚至1/4。免疫組化檢測人結(jié)腸癌配對標本中Caveolin-1和CD36的蛋白表達情況,結(jié)果示：Caveolin-1主要于胞膜和胞漿中表達,在血管和基質(zhì)細胞內(nèi)也可檢測到表達,Caveolin-1于腫瘤中的表達較正常組織明顯降低,P=0.0024。CD36蛋白主要表達在細胞膜,在胞漿、胞核中也有少量表達,相對于正常黏膜,CD36在腸癌的粘膜細胞極少觀察到染色陽性的細胞,表達顯著減少,P0.0001。3、熒光顯微鏡下BODIPY-FA在小鼠結(jié)腸癌模型中成像運用自體對照的方法,于小鼠腸段局部BODIPY-FA染色,組織冰凍切片后熒光顯微鏡成像顯示：在AOM/DSS誘導腸癌的小鼠中,87.1%的腫瘤部位顯示為熒光低信號,相比正常粘膜顯著降低,(腫瘤：0.0836士0.0057,正常：0.1281士0.0106,P=0.0005)：同時BODIPY-FA在炎癥部位的熒光信號強于正常粘膜(炎癥：0.145士0.0212,P=0.4639),有助于判別腫瘤/炎癥/正常組織。在APC-min小鼠中,100%的腺瘤為BODIPY-FA低信號,正常黏膜對其吸收明顯增加,(腫瘤：0.0648士0.018,正常：0.15士0.0178,P=0.0092)。BODIPY-FA染色后成像效果清晰,熒光顯微鏡下除能清晰顯示常規(guī)的腺體結(jié)構(gòu)、細胞排列外,也可對細微結(jié)構(gòu)進行描述,如同另一種形式的免疫組化特異、直觀的展現(xiàn)觀察部位的病變情況。2-NBDG局部噴染不同小鼠模型的腸道,組織切片熒光顯微鏡成像示：熒光強度弱、細胞輪廓不清晰,正常粘膜和腫瘤部位的2-NBDG熒光信號無差異。鹽酸吖啶黃染色后,使黏膜表層粘膜上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、炎癥細胞等胞核均著色,少量能進入細胞質(zhì),腫瘤和正常部位的熒光值無差異。4、激光共聚焦內(nèi)鏡下BODIPY-FA在小鼠結(jié)腸癌模型中成像腫瘤組織在共聚焦內(nèi)鏡下的成像顯示為相對性“暗區(qū)”,在AOM/DSS化學誘導腸癌的小鼠中,85%的腫瘤部位熒光信號低于正常黏膜,平均灰度值明顯降低,(腫瘤：66.27±3.387,正常：121.8±8.281,P0.0001),同時炎癥組織對BODIPY-FA吸收較正常黏膜增多(炎癥：133.4±11.13,P=0.4077)。在APC-min中,100%的腺瘤對BODIPY-FA吸收減少,平均灰度值顯著低于正常部位,(腫瘤：56.23±4.03,正常：148.8±10.85,P0.0001)。同時因共聚焦內(nèi)鏡本身設備的優(yōu)勢,BODIPY-FA染色后可清晰顯示細胞的排列、輪廓、核/質(zhì)比例及反襯下的胞核形態(tài)。將共聚焦內(nèi)鏡與BODIPY-FA染色結(jié)合,通過腫瘤呈現(xiàn)的特異性低信號及細胞、亞細胞水平的成像便于對組織性質(zhì)的判定。同時BODIPY-FA的吸收為主動轉(zhuǎn)運過程,僅具有生物學活性的組織才能較好的顯示其分布,死亡小鼠或斷離時間較長的組織成像效果差。共聚焦內(nèi)鏡結(jié)合2-NBDG局部染色顯像模糊,熒光信號弱,短時間內(nèi)極少進入細胞內(nèi),不能對觀察部位的病變類型作出判斷。使用鹽酸吖啶黃染色的部位,所有組織的胞核均能顯示,不同病變類型無差異。結(jié)論通過上述實驗結(jié)果,我們得出以下結(jié)論：1、BODIPY-FA為脂肪酸的類似物,在短時間內(nèi)可于細胞內(nèi)不斷蓄積。2、相比其他對比劑,BODIPY-FA通過相對“暗區(qū)”特異地顯示腫瘤位置,具有高特異性。3、BODIPY-FA染色后能夠?qū)λ∽冞M行細胞、亞細胞水平的描述,成像清晰,辨析度高。4、在活體共聚焦使用中僅需局部染色,無毒性反應,方法快速、安全、便捷。5、人結(jié)腸癌組織中Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表達顯著降低,腫瘤對BODIPY-FA的吸收減少可能基于此原因。我們通過構(gòu)建小鼠腸癌模型并在體實驗發(fā)現(xiàn),腫瘤組織對于BODIPY-FA的吸收明顯減少,其分子機制可能與Caveolin-1和CD36低表達相關(guān),同時BODIPY-FA與共聚焦內(nèi)鏡的結(jié)合實現(xiàn)了腫瘤特異示蹤及細胞內(nèi)成像,有助于病變的實時定位、定性。本研究為臨床實踐及科研工作提供了發(fā)現(xiàn)早期腫瘤的新思路,具有重要的價值。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 激光共聚焦內(nèi)鏡 脂肪酸代謝 BODIPY-FA
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 第一章 前言24-30
• 第二章 材料和方法30-44
• 1. 實驗材料和試劑30-33
• 2. 實驗儀器33
• 3. 實驗方法33-44
• 第三章 結(jié)果44-57
• 1. BODIPY-FA在腸癌細胞株的吸收曲線及其生物學性狀44-45
• 2. Caveolin-1和CD36在人結(jié)腸癌組織中表達降低45-47
• 3. 熒光顯微鏡下BODIPY-FA在小鼠結(jié)腸癌模型中成像47-52
• 4. 激光共聚焦內(nèi)鏡下BODIPY-FA在小鼠結(jié)腸癌模型中成像52-57
• 第四章 討論57-63
• 參考文獻63-70
• 中英文縮略詞對照表70-71
• 攻讀學位期間成果71-72
• 致謝72-74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Dysregulated lipid metabolism in cancer[J];World Journal of Biological Chemistry;2012年08期

  本文關(guān)鍵詞：激光共聚焦內(nèi)鏡結(jié)合熒光標記的脂肪酸特異檢測大腸癌，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：276103