【摘要】：近年來(lái),圍術(shù)期醫(yī)學(xué)和麻醉治療學(xué)在整個(gè)醫(yī)療過程中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,越來(lái)越多的癲癇患者的麻醉治療和圍術(shù)期管理對(duì)麻醉醫(yī)師提出了新的挑戰(zhàn)。癲癇(Epilepsy)是一類以反復(fù)的癲癇性發(fā)作為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的總稱,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)多部位神經(jīng)元同步異常放電是其最顯著的生理特點(diǎn)。全球癲癇患病率達(dá)到0.5%-1%,我國(guó)目前約有900萬(wàn)癲癇患者。癲癇患者常并發(fā)其他各類認(rèn)知障礙,心境障礙及軀體運(yùn)動(dòng)障礙。目前,臨床上癲癇治療可采用藥物治療、手術(shù)治療等手段。癲癇手術(shù)治療的麻醉難度較高。鎮(zhèn)靜類麻醉藥物對(duì)自發(fā)性腦電活動(dòng)有較大影響,且許多麻醉藥物與抗癲癇藥物具有相同的作用位點(diǎn),術(shù)中麻醉藥物選擇不當(dāng)可能誘發(fā)癲癇發(fā)作。因而,癲癇手術(shù)中應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)穆樽矸桨?既要減少對(duì)皮層腦電圖(ECo G)的不適當(dāng)激發(fā)或抑制,保證致癇灶的定位準(zhǔn)確,也要避免術(shù)中麻醉藥誘發(fā)的癲癇發(fā)作。然而,藥物治療和手術(shù)治療都僅能控制癲癇發(fā)作,并不能預(yù)防由腦損傷等外部因素誘發(fā)的繼發(fā)性癲癇形成。流行病學(xué)調(diào)查顯示,癲癇具有一定的家族傾向性,說明遺傳因素對(duì)于癲癇形成具有一定的影響。因此,從分子水平探討癲癇的發(fā)生機(jī)制,尋找預(yù)防或延緩初始促發(fā)性損傷后(IPI)的慢性癲癇發(fā)生,同時(shí)為癲癇患者的圍術(shù)期管理、麻醉治療及必要的神經(jīng)保護(hù)策略提供新的分子靶標(biāo)具有非常重要的意義。Kruppel-Like Factor 4(KLF4),屬于Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的一員,是真核生物鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,其最早被發(fā)現(xiàn)表達(dá)在口腔、胃腸等消化道的上皮細(xì)胞中。KLF4對(duì)胚胎細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái),陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)KLF4在神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達(dá),并參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化、軸突生長(zhǎng)等關(guān)鍵事件,提示其可能參與了自閉癥、先天性腦積水和腦癱等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病的發(fā)生。目前,未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道KLF4在癲癇發(fā)作及慢性癲癇形成中的作用。基于此背景,本研究對(duì)KLF4對(duì)癲癇的調(diào)控機(jī)制展開研究。目的:KLF4是最近進(jìn)入神經(jīng)生理學(xué)家視野的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,其在胚胎發(fā)育時(shí)期對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的分化和增殖的調(diào)控作用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。傳統(tǒng)抗癲癇藥物對(duì)癲癇病的治療具有較大的局限性,尋找有效的分子靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù),控制癲癇發(fā)作,預(yù)防腦損傷后的慢性癲癇形成已成為神經(jīng)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)問題。本課題提出了科研問題,KLF4是否影響癲癇的發(fā)作,KLF4是否參與戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠活動(dòng)的調(diào)控,旨在通過解決這些問題,闡明轉(zhuǎn)錄因子KLF4和癲癇的關(guān)系,同時(shí)對(duì)KLF4在癲癇以及睡眠活動(dòng)中的調(diào)控作用進(jìn)行初步探討。通過本研究為防治慢性癲癇發(fā)生、發(fā)展,同時(shí)也為癲癇患者的圍術(shù)期管理、麻醉治療及必要的神經(jīng)保護(hù)策略提供理論依據(jù)。GABA-A受體介導(dǎo)的KLF4在癲癇發(fā)作中的影響方法:1.選取16只健康ICR雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和癲癇模型組(PTZ)。利用免疫印記的方法對(duì)小鼠海馬KLF4的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。2.選取24只健康ICR雄性小鼠,隨機(jī)分為PTZ組、PTZ+VPA組和PTZ+CBZ組,每組各8只。觀察戊四唑給藥后20min內(nèi)小鼠癲癇發(fā)作行為的變化。并且,利用免疫印記的方法對(duì)小鼠海馬KLF4的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。3.選取32只健康ICR雄性小鼠,隨機(jī)分為PTZ組、VPA組、蠅蕈醇(Mus)組和氟馬西尼(Flu)組。觀察PTZ給藥后20min內(nèi)小鼠癲癇發(fā)作行為的變化。并且,利用免疫印記的方法對(duì)小鼠海馬KLF4的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:1.比較對(duì)照組和PTZ急性給藥組,PTZ組小鼠海馬KLF4的表達(dá)降低。2.抗癲癇藥物丙戊酸鈉和卡馬西平均能夠顯著延長(zhǎng)戊四唑誘導(dǎo)的急性癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)作潛伏期。而比較兩組發(fā)現(xiàn),VPA組的潛伏期長(zhǎng)于CBZ組。丙戊酸鈉和卡馬西平均能夠顯著降低小鼠癲癇發(fā)作等級(jí)并且促進(jìn)小鼠海馬KLF4表達(dá)。且比較兩組發(fā)現(xiàn),CBZ組KLF4表達(dá)高于VPA組,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.丙戊酸鈉灌胃能夠顯著延長(zhǎng)小鼠的癲癇發(fā)作潛伏期,氟馬西尼腹腔注射能夠顯著拮抗這種作用,Flu組的癲癇發(fā)作潛伏期顯著低于VPA組。Mus組較VPA組的癲癇發(fā)作潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Flu組小鼠的平均癲癇發(fā)作等級(jí)略高于VPA組,比較Mus組和VPA組的癲癇發(fā)作等級(jí),未見顯著性差異。Flu組小鼠海馬的KLF4表達(dá)顯著低于VPA組,而比較Mus組和VPA組,未見顯著性差異。KLF4抗癲癇作用的機(jī)制初步探討方法:選取32只健康ICR小鼠,隨機(jī)分為saline+lv-GFP組,PTZ+lv-GFP組,saline+lv-KLF4組和PTZ+lv-KLF4組。定位向小鼠海馬注射以慢病毒為載體的KLF4過表達(dá)病毒和對(duì)照病毒,注射病毒后待表達(dá)三周,建立海馬KLF4過表達(dá)小鼠模型。按照分組給予PTZ腹腔注射,觀察并記錄給藥后20 min內(nèi)小鼠癲癇行為的變化。并利用免疫熒光染色的方法,觀察各組小鼠海馬和梨狀皮層的c-Fos表達(dá)變化。結(jié)果:1.PTZ+lv-KLF4組小鼠較PTZ+lv-GFP小鼠的癲癇發(fā)作潛伏期顯著延長(zhǎng),同時(shí)其組內(nèi)小鼠的平均發(fā)作等級(jí)也顯著降低。2.PTZ給藥后小鼠海馬和梨狀皮層的c-Fos表達(dá)顯著增多。比較PTZ+lv-KLF4組和PTZ+lv-GFP組小鼠發(fā)現(xiàn),PTZ+lv-KLF4組小鼠海馬和梨狀皮層的c-Fos表達(dá)量顯著減少。KLF4對(duì)戊巴比妥誘導(dǎo)的小鼠睡眠活動(dòng)的影響方法:1.選取16只健康ICR雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和戊巴比妥(Pentobarbital,PBBT)組。通過免疫印記的方法對(duì)給藥后小鼠海馬KLF4表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。2.選取32只健康ICR小鼠,隨機(jī)分為PBBT+lv-GFP組、PBBT+lv-KLF4組、PBBT+si-GFP組和PBBT+si-KLF4四組。定位向小鼠海馬注射以慢病毒為載體的KLF4過表達(dá)病毒和KLF4干擾表達(dá)病毒,及相應(yīng)的對(duì)照病毒,待表達(dá)三周后,按照分組給予戊巴比妥腹腔注射,觀察并記錄給藥后小鼠睡眠行為的變化。結(jié)果:1.急性戊巴比妥腹腔注射后,小鼠海馬KLF4的表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高。2.lv-KLF4組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間都較對(duì)照病毒組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。si-KLF4組小鼠的睡眠潛伏期較對(duì)照病毒組顯著延長(zhǎng)。同時(shí),其睡眠時(shí)間較對(duì)照病毒組顯著減少。結(jié)論:1.丙戊酸鈉和卡馬西平的抗癲癇作用與促進(jìn)海馬KLF4表達(dá)有關(guān)。2.氟馬西尼能夠通過抑制丙戊酸鈉上調(diào)KLF4的作用,拮抗其抗癲癇效應(yīng)。3.KLF4可能通過抑制戊四唑誘導(dǎo)的小鼠海馬和梨狀皮層c-FOS表達(dá),發(fā)揮其抗癲癇作用。4.KLF4能夠參與戊巴比妥誘導(dǎo)的睡眠活動(dòng)的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

24圖 2.2 PTZ 腹腔注射對(duì) KLF4 表達(dá)的影響（A）海馬 KLF4 表達(dá)量 （B）海馬 KLF4 表達(dá)條帶。注：*P<0.05，與對(duì)照組比較。

CBZ 腹腔注射組較 PTZ 組均能夠顯著降低癲癇發(fā)作等級(jí)（P<0.001）。VPA 灌胃組對(duì)癲癇發(fā)作潛伏期和發(fā)作等級(jí)的影響較 CBZ 腹腔注射組更顯著（P<0.01）。表 2.1 不同抗癲癇藥物對(duì)小鼠陣攣性發(fā)作潛伏期和發(fā)作等級(jí)的影響組別 動(dòng)物數(shù) 陣攣性發(fā)作潛伏期（s） 平均發(fā)作等級(jí)PTZ 8 92.75±7.34 4.75±0.16PTZ+VPA 8 232.50±19.66*** 1.5±0.27***PTZ+CBZ 8 176.00±21.36**,#2.50±0.33***,#注：數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SE)表示，PTZ: 65 mg/kg, i.p. ；VPA：400mg/kg, p.o. ；CBZ：10mg/kg i.p.；**P<0.01 與 PTZ 組比較；***P＜0.001 與 PTZ 組比較；#P<0.05 與PTZ+VPA 組比較

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本文編號(hào)：2715539