【摘要】：第一部分大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析[目的]探討大鼠DCD供體原位肝移植模型穩(wěn)定建立的技巧及其經(jīng)驗總結。[方法]通過改良Kamada“二袖套”法,對三組(A組熱缺血0min40對,B組熱缺血10min40對,C組熱缺血20min40對)SD大鼠施行原位肝移植,術后記錄分析大鼠24h,72h,7天生存率和死亡原因。[結果]術后24h生存率A組92.5%,B組90.0%,C組92.5%;術后72h生存率A組 90.0%,B 組 80.0%,C 組 77.5%;術后 7 天生存率 A 組 85.0%,B 組 70.0%,C組57.5%。3組術后24h和術后72h生存率差異均無顯著性(p0.05)。但3組術后7天生存率不全相同(p0.05)。7天生存率C組比A組顯著降低(p=0.0167)。術后24h內死亡原因多為手術操作不足,術后膽漏、缺血性肝衰竭多在24h-72h死亡,手術3天-7天死亡原因多為膽道并發(fā)癥,且隨著熱缺血時間的延長,膽道并發(fā)癥的發(fā)生率增高。[結論]建立了穩(wěn)定的大鼠DCD原位肝移植模型。大鼠DCD原位肝移植模型的穩(wěn)定建立關鍵在于保護肝臟和膽道功能,難點在于肝上下腔靜脈的吻合和縮短無肝期。第二部分熱缺血時間與大鼠DCD原位肝移植術后CaMKⅡ、肝細胞凋亡及線粒體凋亡的關系[目的]研究在大鼠DCD原位肝移植中,供肝不同熱缺血時間與大鼠DCD原位肝移植術后CaMK Ⅱ和肝細胞凋亡、線粒體凋亡的關系[方法]建立大鼠DCD肝移植模型,A組(熱缺血Omin)、B組(熱缺血1Omin)、C組(熱缺血20min),三組分別于肝移植術后1d、3d、7d隨機處死6只大鼠,取肝細胞流式細胞技術AnnexinV-FITC/PI標記測肝細胞凋亡率和JC-10標記測肝細胞線粒體膜電位水平,取肝組織標本QRT-PCR測肝組織CaM mRNA、CaMK Ⅱ γmRNA定量,Western blot測肝組織CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝細胞質CytC、AIF定量。[結果]術后3天,7天,肝細胞JC-10標記測得綠色熒光細胞百分比C組較A組、B組升高,(P0.05)。B組較A組高(P0.05)。三組術后同一時間點細胞早期凋亡率、晚期凋亡率、壞死率C組較B組和A組高,B組較A組高(p0.05)。CaM、CaMKⅡγ、CytC、AIF表達量術后一天各組間差異無顯著性,術后3天、7天C組高于B組和A組(P0.05),而B組高于A組(P0.05)。[結論]在大鼠DCD原位肝移植中,隨著供肝經(jīng)歷熱缺血時間的延長,術后肝細胞線粒體凋亡和細胞凋亡逐漸增加,肝細胞質CytC、AIF表達量,肝組織CaM、CaMKⅡ表達量逐漸上調。提示CaM、CaMKⅡ與大鼠DCD肝移植術后細胞及線粒體凋亡相關,并在大鼠DCD原位肝移植術后肝細胞線粒體凋亡途徑的細胞凋亡中起著十分關鍵的作用。第三部分CaMK Ⅱ表達在大鼠DCD肝移植術后細胞和線粒體凋亡中的初步研究[目的]探究CaMK Ⅱ在大鼠DCD原位肝移植術后肝細胞線粒體凋亡和細胞凋亡中的作用。[方法]通過建立熱缺血10min的大鼠DCD原位肝移植模型,注射靶向CaMK Ⅱγ基因、CaMKⅡγ-shRNA慢病毒轉染,上調和下調模型肝細胞CaMKⅡ表達量。1B組(生理鹽水空白組),2B組(CaMK Ⅱγ過表達空載體組),3B組(CaMK Ⅱγ過表達組),4B組(CaMK Ⅱγ干擾表達空載體組),5B組(CaMK Ⅱγ干擾表達組),于術后1天、3天、7天、30天隨機處死3只大鼠,流式細胞技術測肝細胞凋亡率和肝細胞線粒體膜電位水平,取肝組織標本QRT-PCR測肝組織CaMmRNA、CaMK ⅡγmRNA定量,Western blot檢測肝組織CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝細胞質CytC、AIF定量。[結果]五組術后同一時間點肝細胞JC-10標記測得綠色熒光細胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率、壞死細胞率3B組明顯高于1B和2B組(P0.05),5B組明顯低于1B組和4B組(P0.05),而1B、2B、4B差異無顯著性(P0.05)。CaM、CaMK Ⅱγ、CytC、AIF表達量術后一天各組間差異無顯著性,術后3天、7天、30天3B組明顯高于1B和2B組(P0.05),5B組明顯低于1B組和4B組(P0.05),而1B、2B、4B差異無顯著性(P0.05)。[結論]大鼠DCD原位肝移植術后自大鼠陰莖背靜脈注入慢病毒進行轉染,此方法簡單、安全、有效。在大鼠DCD原位肝移植中,上調肝細胞CaMKⅡγ表達量后,移植肝肝細胞線粒體凋亡和細胞凋亡率升高。反之,干擾下調肝細胞CaMKⅡ表達后,移植肝肝細胞線粒體凋亡和細胞凋亡率降低。反應了CaMKⅡ參與大鼠DCD原位肝移植術后肝細胞線粒體凋亡及細胞凋亡過程的調控。由此推斷,在DCD肝移植術后,若能特異性阻斷CaMK Ⅱ信號通路,則可達到減少肝細胞凋亡的目的。
【圖文】：

依次剪斷肝鐮狀韌帶、肝左三角韌帶、肝后韌帶、肝胃韌帶。緊貼ＳＨＹＣ用８－０逡逑^6針縫線縫扎左隔下靜脈，５－０絲線結扎肝食管靜脈叢。游離膽總管，于肝管匯逡逑合處遠端約０．８－１邋ｃｍ處剪一斜口，膽管支撐管自斜口插入膽管（圖５）約０．４ｃｍ，逡逑５－０絲線結扎固定，并預留約ｌｃｍ線頭。游離門靜脈及其分支、肝動脈，并切斷逡逑肝動脈。結扎脾靜脈，于腸系膜上、下靜脈分叉處剪斷門靜脈，形成喇叭口狀。逡逑鈍性分離ＩＨＶＣ至左腎靜脈處，分別結扎切斷右腎靜脈、右腎上腺靜脈、腰靜逡逑脈，在左腎靜脈與下腔靜脈交叉處剪斷ＩＨＶＣ。剪斷右三角韌帶和肝臟背面韌逡逑帶，，緊貼腦肌環(huán)剪斷肝上下腔靜脈（ｓｕｐｒａｈｅｐａｔｉｃｖｅｎａｃａｖａ，ＳＨＶＣ），保持斷端逡逑平整。取出供體肝臟，置于0－４°Ｃ保存液中。逡逑２．２．３供肝的修整逡逑供肝置于0－４°Ｃ保存液中。單人套管，彎蚊式鉗夾住門靜脈套管柄，蚊式鉗逡逑柄固定于橡皮泥上

供肝置于0－４°Ｃ保存液中。單人套管，彎蚊式鉗夾住門靜脈套管柄，蚊式鉗逡逑柄固定于橡皮泥上，套管固定，用顯微血管鉗伸入套管中將門靜脈輕輕拉出反逡逑套于套管上，５－０絲線固定。同理完成ＴＨＶＣ的套管（圖６）。ＳＨＶＣ左右兩個逡逑１４逡逑
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：2699258