【摘要】：第一部分大鼠DCD原位肝移植模型的建立及死亡原因分析[目的]探討大鼠DCD供體原位肝移植模型穩(wěn)定建立的技巧及其經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。[方法]通過改良Kamada“二袖套”法,對(duì)三組(A組熱缺血0min40對(duì),B組熱缺血10min40對(duì),C組熱缺血20min40對(duì))SD大鼠施行原位肝移植,術(shù)后記錄分析大鼠24h,72h,7天生存率和死亡原因。[結(jié)果]術(shù)后24h生存率A組92.5%,B組90.0%,C組92.5%;術(shù)后72h生存率A組 90.0%,B 組 80.0%,C 組 77.5%;術(shù)后 7 天生存率 A 組 85.0%,B 組 70.0%,C組57.5%。3組術(shù)后24h和術(shù)后72h生存率差異均無顯著性(p0.05)。但3組術(shù)后7天生存率不全相同(p0.05)。7天生存率C組比A組顯著降低(p=0.0167)。術(shù)后24h內(nèi)死亡原因多為手術(shù)操作不足,術(shù)后膽漏、缺血性肝衰竭多在24h-72h死亡,手術(shù)3天-7天死亡原因多為膽道并發(fā)癥,且隨著熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng),膽道并發(fā)癥的發(fā)生率增高。[結(jié)論]建立了穩(wěn)定的大鼠DCD原位肝移植模型。大鼠DCD原位肝移植模型的穩(wěn)定建立關(guān)鍵在于保護(hù)肝臟和膽道功能,難點(diǎn)在于肝上下腔靜脈的吻合和縮短無肝期。第二部分熱缺血時(shí)間與大鼠DCD原位肝移植術(shù)后CaMKⅡ、肝細(xì)胞凋亡及線粒體凋亡的關(guān)系[目的]研究在大鼠DCD原位肝移植中,供肝不同熱缺血時(shí)間與大鼠DCD原位肝移植術(shù)后CaMK Ⅱ和肝細(xì)胞凋亡、線粒體凋亡的關(guān)系[方法]建立大鼠DCD肝移植模型,A組(熱缺血Omin)、B組(熱缺血1Omin)、C組(熱缺血20min),三組分別于肝移植術(shù)后1d、3d、7d隨機(jī)處死6只大鼠,取肝細(xì)胞流式細(xì)胞技術(shù)AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記測(cè)肝細(xì)胞凋亡率和JC-10標(biāo)記測(cè)肝細(xì)胞線粒體膜電位水平,取肝組織標(biāo)本QRT-PCR測(cè)肝組織CaM mRNA、CaMK Ⅱ γmRNA定量,Western blot測(cè)肝組織CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝細(xì)胞質(zhì)CytC、AIF定量。[結(jié)果]術(shù)后3天,7天,肝細(xì)胞JC-10標(biāo)記測(cè)得綠色熒光細(xì)胞百分比C組較A組、B組升高,(P0.05)。B組較A組高(P0.05)。三組術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、壞死率C組較B組和A組高,B組較A組高(p0.05)。CaM、CaMKⅡγ、CytC、AIF表達(dá)量術(shù)后一天各組間差異無顯著性,術(shù)后3天、7天C組高于B組和A組(P0.05),而B組高于A組(P0.05)。[結(jié)論]在大鼠DCD原位肝移植中,隨著供肝經(jīng)歷熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng),術(shù)后肝細(xì)胞線粒體凋亡和細(xì)胞凋亡逐漸增加,肝細(xì)胞質(zhì)CytC、AIF表達(dá)量,肝組織CaM、CaMKⅡ表達(dá)量逐漸上調(diào)。提示CaM、CaMKⅡ與大鼠DCD肝移植術(shù)后細(xì)胞及線粒體凋亡相關(guān),并在大鼠DCD原位肝移植術(shù)后肝細(xì)胞線粒體凋亡途徑的細(xì)胞凋亡中起著十分關(guān)鍵的作用。第三部分CaMK Ⅱ表達(dá)在大鼠DCD肝移植術(shù)后細(xì)胞和線粒體凋亡中的初步研究[目的]探究CaMK Ⅱ在大鼠DCD原位肝移植術(shù)后肝細(xì)胞線粒體凋亡和細(xì)胞凋亡中的作用。[方法]通過建立熱缺血10min的大鼠DCD原位肝移植模型,注射靶向CaMK Ⅱγ基因、CaMKⅡγ-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染,上調(diào)和下調(diào)模型肝細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)量。1B組(生理鹽水空白組),2B組(CaMK Ⅱγ過表達(dá)空載體組),3B組(CaMK Ⅱγ過表達(dá)組),4B組(CaMK Ⅱγ干擾表達(dá)空載體組),5B組(CaMK Ⅱγ干擾表達(dá)組),于術(shù)后1天、3天、7天、30天隨機(jī)處死3只大鼠,流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)肝細(xì)胞凋亡率和肝細(xì)胞線粒體膜電位水平,取肝組織標(biāo)本QRT-PCR測(cè)肝組織CaMmRNA、CaMK ⅡγmRNA定量,Western blot檢測(cè)肝組織CaM、CaMK Ⅱγ定量,肝細(xì)胞質(zhì)CytC、AIF定量。[結(jié)果]五組術(shù)后同一時(shí)間點(diǎn)肝細(xì)胞JC-10標(biāo)記測(cè)得綠色熒光細(xì)胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率、壞死細(xì)胞率3B組明顯高于1B和2B組(P0.05),5B組明顯低于1B組和4B組(P0.05),而1B、2B、4B差異無顯著性(P0.05)。CaM、CaMK Ⅱγ、CytC、AIF表達(dá)量術(shù)后一天各組間差異無顯著性,術(shù)后3天、7天、30天3B組明顯高于1B和2B組(P0.05),5B組明顯低于1B組和4B組(P0.05),而1B、2B、4B差異無顯著性(P0.05)。[結(jié)論]大鼠DCD原位肝移植術(shù)后自大鼠陰莖背靜脈注入慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,此方法簡(jiǎn)單、安全、有效。在大鼠DCD原位肝移植中,上調(diào)肝細(xì)胞CaMKⅡγ表達(dá)量后,移植肝肝細(xì)胞線粒體凋亡和細(xì)胞凋亡率升高。反之,干擾下調(diào)肝細(xì)胞CaMKⅡ表達(dá)后,移植肝肝細(xì)胞線粒體凋亡和細(xì)胞凋亡率降低。反應(yīng)了CaMKⅡ參與大鼠DCD原位肝移植術(shù)后肝細(xì)胞線粒體凋亡及細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控。由此推斷,在DCD肝移植術(shù)后,若能特異性阻斷CaMK Ⅱ信號(hào)通路,則可達(dá)到減少肝細(xì)胞凋亡的目的。
【圖文】：

依次剪斷肝鐮狀韌帶、肝左三角韌帶、肝后韌帶、肝胃韌帶。緊貼ＳＨＹＣ用８－０逡逑^6針縫線縫扎左隔下靜脈，５－０絲線結(jié)扎肝食管靜脈叢。游離膽總管，于肝管匯逡逑合處遠(yuǎn)端約０．８－１邋ｃｍ處剪一斜口，膽管支撐管自斜口插入膽管（圖５）約０．４ｃｍ，逡逑５－０絲線結(jié)扎固定，并預(yù)留約ｌｃｍ線頭。游離門靜脈及其分支、肝動(dòng)脈，并切斷逡逑肝動(dòng)脈。結(jié)扎脾靜脈，于腸系膜上、下靜脈分叉處剪斷門靜脈，形成喇叭口狀。逡逑鈍性分離ＩＨＶＣ至左腎靜脈處，分別結(jié)扎切斷右腎靜脈、右腎上腺靜脈、腰靜逡逑脈，在左腎靜脈與下腔靜脈交叉處剪斷ＩＨＶＣ。剪斷右三角韌帶和肝臟背面韌逡逑帶，，緊貼腦肌環(huán)剪斷肝上下腔靜脈（ｓｕｐｒａｈｅｐａｔｉｃｖｅｎａｃａｖａ，ＳＨＶＣ），保持?jǐn)喽隋义掀秸Ｈ〕龉w肝臟，置于0－４°Ｃ保存液中。逡逑２．２．３供肝的修整逡逑供肝置于0－４°Ｃ保存液中。單人套管，彎蚊式鉗夾住門靜脈套管柄，蚊式鉗逡逑柄固定于橡皮泥上

供肝置于0－４°Ｃ保存液中。單人套管，彎蚊式鉗夾住門靜脈套管柄，蚊式鉗逡逑柄固定于橡皮泥上，套管固定，用顯微血管鉗伸入套管中將門靜脈輕輕拉出反逡逑套于套管上，５－０絲線固定。同理完成ＴＨＶＣ的套管（圖６）。ＳＨＶＣ左右兩個(gè)逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2699258