本文關(guān)鍵詞：硫化氫通過增強自噬減輕腎臟缺血再灌注損傷，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是指在缺血一段時間后恢復血流供應,組織器官會受到一定的損傷。腎臟IRI在臨床中是比較常見的病理生理過程,是導致缺血性急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的重要因素之一。在臨床上很多情況下均會發(fā)生腎臟IRI,例如外科手術(shù)、創(chuàng)傷、麻醉意外、心肺復蘇、休克、敗血癥和腎移植等。臨床上引起急性腎損傷的重要原因之一就是腎臟IRI,因此預防和治療腎臟IRI是臨床上迫切需要解決的問題。硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)是在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的繼一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)之后的第三種氣體信號分子,在體內(nèi)可內(nèi)源性生成H_2S并廣泛參與機體的生理和病理生理過程。研究顯示,H_2S對腦、肝臟和腎臟等多種組織缺血、缺氧損傷具有保護作用。自噬是細胞處于饑餓、缺氧或感染時,在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,把細胞質(zhì)內(nèi)部的糖類、蛋白質(zhì)等分子或受損的細胞器包裹成囊泡后與溶酶體進行融合形成自噬溶酶體,利用溶酶體內(nèi)的酶降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)成小分子物質(zhì),為細胞修復、更新提供原料與營養(yǎng)、保持能量穩(wěn)態(tài)的過程,是有別于凋亡的另一種細胞程序性死亡機制。研究表明H_2S在肝臟和心臟IRI過程中通過抑制自噬的發(fā)生起到保護作用。研究發(fā)現(xiàn)H_2S在腎臟IRI過程對腎臟起到保護作用,但是H_2S是通過抑制自噬還是促進增強自噬對腎臟起到保護作用尚不清楚。目的探討不同濃度硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS,H_2S的供體)預處理產(chǎn)生的H_2S對小鼠腎臟IRI的保護作用及機制。方法1.小鼠腎臟IRI模型的建立及實驗分組實驗分為5組:sham組、IR組、28μmol NaHS組、56μmol NaHS組和100μmol NaHS組。在手術(shù)前20min腹腔注射給予H_2S的供體NaHS。腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(75mg/kg體重)全身麻醉后,消毒鋪巾。背部中線兩側(cè)腎區(qū)切口,用玻璃分針鈍性分離腎臟周圍肌肉組織和腎筋膜,用無創(chuàng)傷動脈夾輕輕夾閉雙側(cè)腎臟動脈血管導致腎缺血,腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)樯n白色。腎臟缺血45min后輕輕松開動脈夾,腎臟立即恢復血流供給,顏色由暗紅色逐漸變?yōu)轷r紅色,表明腎臟再灌注成功。逐層縫合肌肉和皮層,消毒傷口。動物自由攝取食物和水。于手術(shù)后24h處死小鼠,收集血液和腎臟。2.小鼠腎功能檢測采用肌氨酸氧化酶法檢測小鼠血漿中血肌酐(Scr)含量;采用脲酶法檢測小鼠血漿中尿素氮(Bun)含量;采用雙抗體夾心ELISA法檢測小鼠血漿中胱抑素(Cys-c)含量。3.小鼠腎臟組織形態(tài)學觀察:小鼠腎臟組織用4%多聚甲醛固定后包埋,制成石蠟切片,HE染色后觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)變化;小鼠腎臟組織用2.5%的戊二醛固定后用環(huán)氧樹脂包埋,醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。4.小鼠腎臟組織抗氧化物檢測采用WST-1法檢測小鼠腎臟組織總超氧化物歧化酶(SOD)活力;采用TBA法測定小鼠腎臟組織丙二醛(MDA)含量。5.小鼠腎臟組織抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax表達情況檢測采用Western-blot方法檢測分析小鼠腎臟組織Bcl-2和Bax蛋白表達情況。6.小鼠腎臟組織LC3,Beclin-1和P62的表達情況檢測采用Western-blot方法檢測分析小鼠腎臟組織Beclin-1和LC3蛋白表達情況;采用免疫組織化學方法檢測小鼠腎臟組織P62蛋白的表達情況。結(jié)果1.H_2S預處理后可以明顯改善由于腎臟IRI導致的腎功能改變:與sham相比較,IR組小鼠血漿中Scr,Bun和Cys-C顯著升高(P0.01);與IR組相比較,28μmol NaHS組小鼠血漿中Scr和Bun下降不明顯(P0.05),Cys-C明顯降低(P0.05);56μmol NaHS組和100μmol NaHS組小鼠血漿中Scr,Bun和Cys-C明顯降低(P0.05)。2.H_2S預處理后可以明顯改善由于腎臟IRI導致的腎臟結(jié)構(gòu)病變情況:與sham相比較,IR組小鼠病變明顯,HE染色顯示腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處腎小管細胞壞死脫落;電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)顯示,IR組小鼠腎臟內(nèi)線粒體脊和膜有融合有消失,核質(zhì)有腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴張,有脫顆粒,核周隙擴張,病變嚴重。與IR組相比較,28μmol NaHS組、56μmol NaHS組和100μmol NaHS組小鼠腎臟病變明顯得到改善。3.H_2S預處理后可以明顯提高腎臟對氧自由基的清除能力,提高組織內(nèi)總抗氧化能力:與sham相比較,IR組小鼠腎臟中SOD活力明顯降低(P0.05),MDA含量顯著升高(P0.01);與IR組相比較,28μmol NaHS組、56μmol NaHS組和100μmol NaHS小鼠腎臟中SOD活力明顯升高(P0.05),MDA含量顯著降低(P0.05)。4.H_2S預處理后可以明顯改善腎臟的細胞凋亡情況:與sham相比較,IR組小鼠腎臟中Bcl-2蛋白表達量下降(P0.01),Bax和Caspase 3蛋白表達量升高(P0.01);與IR組相比較,28μmol NaHS組小鼠腎臟中Bcl-2蛋白表達量升高(P0.05),Bax蛋白表達量下降(P0.05),Caspase 3蛋白表達下降不明顯(P0.05);56μmol NaHS組和100μmol NaHS組小鼠腎臟中Bcl-2蛋白表達量升高(P0.05),Bax和Caspase 3蛋白表達量下降(P0.05)。5.H_2S預處理后可以明顯提高腎臟的自噬水平:與sham相比較,IR組小鼠腎臟組織中P62蛋白表達量顯著升高,LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達量明顯升高(P0.05);與IR組相比較,28μmol NaHS組小鼠腎臟組織中LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達量升高不明顯(P0.05);56μmol NaHS組小鼠腎臟組織中LC-3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量升高不明顯(P0.05),Beclin1蛋白表達量明顯升高(P0.05);100μmol NaHS組小鼠腎臟組織中LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表達量明顯升高(P0.05);28μmol NaHS組、56μmol NaHS組和100μmol NaHS組小鼠腎臟組織中P62蛋白表達量下降。結(jié)論1.H_2S對腎臟IRI的保護作用可能部分是通過提高腎臟抗氧化和抗凋亡能力來發(fā)揮的。2.H_2S預處理后可能通過增強自噬減輕腎臟IRI。3.56μmol NaHS和100μmol NaHS預處理對腎臟IRI的保護作用比較明顯。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注 急性腎損傷 硫化氫 抗氧化 抗凋亡 自噬
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 英文縮略詞表10-14
• 前言14-18
• 1 材料與方法18-30
• 1.1 實驗動物18
• 1.1.1 動物飼料和動物造模試劑18
• 1.2 實驗試劑18-22
• 1.2.1 蛋白檢測所用試劑盒18
• 1.2.2 血液生化分析試劑盒18-19
• 1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（ELISA KIT）19
• 1.2.4 氧化抗氧化檢測試劑盒19-20
• 1.2.5 病理組織切片所用試劑20-21
• 1.2.6 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒21
• 1.2.7 Western blot試劑和耗材21
• 1.2.8 一抗和二抗21-22
• 1.2.9 免疫組化試劑和耗材22
• 1.3 主要儀器及設備22-23
• 1.4 主要試劑配制23-30
• 1.4.1 不同濃度NaHS溶液的配制23
• 1.4.2 HE染色液體23-24
• 1.4.3 灌流液和固定液24
• 1.4.4 Western Blot試劑24-28
• 1.4.5 免疫組化試劑28-30
• 2 實驗方法與步驟30-48
• 2.1 小鼠腎臟IRI模型的建立及實驗分組30-32
• 2.2 小鼠血液和腎臟樣本的收集與處理32
• 2.3 小鼠腎功能指標檢測32-34
• 2.3.1 肌氨酸氧化酶法檢測小鼠血肌酐（Scr）水平32-33
• 2.3.2 脲酶法檢測小鼠血液中尿素氮（BUN）水平33
• 2.3.3 ELISA法測定小鼠血液中胱抑素C（Cys-C）水平33-34
• 2.4 小鼠腎臟組織形態(tài)學觀察34-36
• 2.4.1 石蠟組織切片HE染色制作34-35
• 2.4.2 電鏡圖片的制作35-36
• 2.5 小鼠腎臟抗氧化能力檢測36-39
• 2.5.1 采用WST-1 法檢測小鼠腎臟組織總超氧化物歧化酶（SOD）活力36-38
• 2.5.2 采用TBA法測定小鼠腎臟組織丙二醛（MDA）含量38-39
• 2.6 小鼠腎臟組織抗凋亡水平檢測39-42
• 2.6.1 Western Blot法檢測鼠腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 和Caspase-3 的表達水平39-42
• 2.6.2 一步法TUNEL檢測小鼠腎臟細胞凋亡情況42
• 2.7 小鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白表達水平檢測42-46
• 2.7.1 Western Blot法檢測鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin 1 的表達水平42-45
• 2.7.2 免疫組化法檢測鼠腎臟組織自噬相關(guān)蛋白P62的表達水平45-46
• 2.8 統(tǒng)計學處理46-48
• 3 實驗結(jié)果48-58
• 3.1 H_2S預處理可以明顯改善由于腎臟IRI導致的腎功能改變48-49
• 3.2 H_2S預處理后可以明顯改善由于腎臟IRI導致的腎臟病變情況49-51
• 3.3 H_2S預處理后可以明顯提高腎臟對氧自由基的清除能力，，提高組織內(nèi)總抗氧化能力51-52
• 3.4 H_2S預處理后可以明顯改善腎臟的細胞凋亡情況52-53
• 3.5 H_2S預處理后可以明顯提高腎臟的自噬水平53-58
• 3.5.1 H_2S預處理后可以明顯改善腎臟組織受損的超微結(jié)構(gòu)53-55
• 3.5.2 H_2S預處理后可以明顯提高腎臟組織自噬相關(guān)蛋白LC-3和Beclin-1的表達55-56
• 3.5.3 H_2S預處理后可以明顯降低腎臟組織自噬相關(guān)蛋白P62的表達56-58
• 4 討論58-64
• 5 結(jié)論64-66
• 參考文獻66-72
• 致謝72-74
• 碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文74-75

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