發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 03:06

【摘要】：第一部分Sec22b及Ykt6與腦缺血再灌注的相關(guān)性研究目的:研究大鼠腦缺血再灌注(MCAO/R)后腦組織中Sec22b及Ykt6的蛋白表達(dá)水平及其分布的變化。方法:(1)隨機(jī)選取30只SD大鼠分為以下5組:假手術(shù)組、MCAO/R后6h、12h、24h、48h,每組6只大鼠。所有大鼠均在腦組織缺血再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)被處死。取大鼠腦梗側(cè)腦組織,通過Western blot分析及免疫熒光技術(shù)來檢測Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情況。(2)培養(yǎng)大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞,隨機(jī)分為以下5組:正常對照組、OGD/R后6h、12h、24h、48h。所有神經(jīng)元細(xì)胞均在氧糖剝奪再灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞,通過Western blot分析及免疫熒光技術(shù)來檢測神經(jīng)元內(nèi)Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情況。結(jié)果:1、大鼠腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)的Sec22b水平呈先上升后下降的變化,以MCAO/R后24h組Sec22b蛋白水平上升最為顯著(P0.01);而Ykt6水平呈逐漸下降趨勢,在所研究的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)以MCAO/R后48h組Ykt6蛋白水平下降至最低(P0.05)。2、神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注后神經(jīng)元內(nèi)的Sec22b水平同樣呈先上升后下降的變化,以O(shè)GD/R后24h組Sec22b蛋白水平上升最為顯著(P0.01);而Ykt6水平同樣呈逐漸下降趨勢,在所研究的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)以O(shè)GD/R后48h組Ykt6蛋白水平下降至最低(P0.05)。3、體內(nèi)免疫熒光結(jié)果顯示Sec22b在腦缺血再灌注后24h細(xì)胞內(nèi)的定位明顯升高;體外免疫熒光結(jié)果顯示氧糖剝奪再灌注后24h神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Sec22b主要聚集在神經(jīng)元軸突的末梢。結(jié)論:MCAO/R后Sec22b的表達(dá)水平明顯升高,并且主要積聚在神經(jīng)元軸突的末梢;而Ykt6的表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢。第二部分Sec22b及Ykt6在腦缺血再灌注損傷中所起的作用目的:探索通過Sec22b及Ykt6質(zhì)粒和小干擾RNA的干預(yù)后Sec22b及Ykt6在腦缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布情況,以及其發(fā)生的變化在大鼠腦缺血再灌注損傷中所起的作用。方法:隨機(jī)選取144只SD大鼠,分為以下8組:假手術(shù)組、MCAO/R組、MCAO/R+Ctr Si RNA組、MCAO/R+Si RNA-Sec22b組、MCAO/R+Si RNA-Ykt6組、MCAO/R+Vehicle組、MCAO/R+Over-Sec22b組、MCAO/R+Over-Ykt6組,每組18只。在轉(zhuǎn)染Sec22b或Ykt6質(zhì)粒與小干擾RNA后48h造模。在腦缺血再灌注后24h取出腦組織進(jìn)行TUNEL染色和FJB染色,同時(shí)取其血液行ELISA檢測;另取每組6只大鼠造模24h后取其梗死側(cè)腦組織進(jìn)行Western blot分析及免疫熒光分析。再取每組6只大鼠造模24h后取其腦組織行TTC染色。結(jié)果:1、過表達(dá)Sec22b使其在腦組織內(nèi)的表達(dá)水平及分布明顯上升,而小干擾RNA處理后其水平及分布顯著下降。2、過表達(dá)Ykt6使其在腦組織內(nèi)的表達(dá)水平明顯上升,而小干擾RNA處理后其水平顯著下降。3、在體內(nèi)TUNEL染色、FJB染色及ELISA檢測結(jié)果表明:過表達(dá)Ykt6可顯著降低腦缺血再灌注后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、壞死及炎癥反應(yīng),而過表達(dá)Sec22b后顯著加重了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、壞死和炎癥反應(yīng);抑制Ykt6的表達(dá)很大程度上可加重神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、壞死和炎癥反應(yīng),而抑制Sec22b的表達(dá)卻可適當(dāng)減輕神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、壞死和炎癥反應(yīng)。4、根據(jù)TTC染色結(jié)果顯示:過表達(dá)Ykt6和下調(diào)Sec22b能使腦梗死面積縮小,而過表達(dá)Sec22b和下調(diào)Ykt6卻使腦梗死面積增大。結(jié)論:Sec22b水平的升高或Ykt6水平的下降可一定程度上加重腦缺血再灌注損傷,而Sec22b水平的下降或Ykt6水平的上升在很大程度上能減輕腦缺血再灌注損傷。第三部分Sec22b及Ykt6在氧糖剝奪再灌注后體外神經(jīng)元內(nèi)所起的作用及其在繼發(fā)損傷細(xì)胞自噬中的作用目的:通過Sec22b及Ykt6質(zhì)粒和小干擾RNA干預(yù)原代神經(jīng)元后檢測其OGD/R后神經(jīng)元TUNEL染色、ELISA、LDH來驗(yàn)證Sec22b及Ykt6對氧糖剝奪再灌注損傷的作用,并通過免疫熒光檢測自噬特異性蛋白LC3的定位及其與Sec22b和Ykt6的結(jié)合程度來評估其對細(xì)胞自噬的影響程度。方法:培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞,將其分為以下8組:正常對照組、OGD/R組、OGD/R+Ctr Si RNA組、OGD/R+Si RNA-Sec22b組、OGD/R+Si RNA-Ykt6組、OGD/R+Vehicle組、OGD/R+Over-Sec22b組、OGD/R+Over-Ykt6組。通過TUNEL染色、ELISA、LDH來檢測神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、炎癥及壞死情況,并通過免疫熒光來評估細(xì)胞自噬。結(jié)果:1、體外TUNEL染色、ELISA、LDH結(jié)果表明:過表達(dá)Ykt6或者抑制Sec22b的表達(dá)可減輕神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、炎癥及壞死情況;而過表達(dá)Sec22b或者抑制Ykt6的表達(dá)可加重神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡、炎癥和壞死情況。2、當(dāng)發(fā)生氧糖剝奪再灌注后自噬特異性蛋白表達(dá)上升,其與Sec22b的結(jié)合程度較正常時(shí)有所下降,而其與Ykt6的結(jié)合程度較正常時(shí)明顯上升。結(jié)論:體外氧糖剝奪再灌注后所引起的損傷會因?yàn)镾ec22b水平的上升或者Ykt6水平的下降而得以加重,但當(dāng)Sec22b水平下降或者Ykt6水平上升,氧糖剝奪再灌注損傷會有所緩解。另一方面,當(dāng)發(fā)生氧糖剝奪再灌注后細(xì)胞自噬加強(qiáng),根據(jù)與自噬特異性蛋白的結(jié)合程度可以看出,Ykt6在氧糖剝奪再灌注后的自噬中其中重要作用。
【圖文】：

1 第一部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖：此圖分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分，體內(nèi)實(shí)及腦缺血再灌注后不同時(shí)間組，共計(jì) 5 組，，體外實(shí)驗(yàn)分正常組及氧糖剝同時(shí)間組，共計(jì) 5 組，主要通過 Western blot 及免疫熒光技術(shù)來驗(yàn)證在損傷后 Sec22b 及 Ykt6 的表達(dá)水平變化及亞細(xì)胞分布情況。 大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注模型的建立1）4%水合氯醛（藥物效量：10ml/kg）對 SD 大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。2）麻醉成功后，將大鼠仰臥于操作臺上，頸部去毛備皮，酒精常規(guī)消3）作右側(cè)頸部旁切口，鈍性分離肌肉，尋找頸動脈鞘，分離頸總動脈在離頸動脈約 0.8cm 處結(jié)扎頸總動脈近心端。4）分離頸外動脈和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，在頸內(nèi)動脈起始端放置用絲線，不收緊線結(jié)。5）用一把眼科剪輕墊于右側(cè)頸總動脈末端的后方，用另一把眼科剪在

5 MCAO/R 后 TTC 染色后顯腦缺血再灌注模型的建立：前一天包板，消毒相關(guān)手術(shù)的SD孕鼠斷頸處死，酒精浸并減輕它們的痛苦。除其腦表面血管及腦膜后，PBS沖洗3次白酶消化分解腦組織，置于，加入PBS沖洗3次。懸液，過篩，收集細(xì)胞懸液500×g離心5分鐘，棄去上清
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 Wenqi Chen;Yinyi Sun;Kangyong Liu;Xiaojiang Sun;;Autophagy: a double-edged sword for neuronal survival after cerebral ischemia[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

本文編號：2641012