【摘要】：研究背景在我國(guó),隨著麻醉技術(shù)水平不斷發(fā)展和“二胎”政策的開(kāi)放,每年有成千上萬(wàn)名新生兒及嬰幼兒甚至孕婦需接受必要的診斷性檢查、手術(shù)以及鎮(zhèn)痛治療等,需要進(jìn)行全身麻醉。既往認(rèn)為,全身麻醉是一種可逆性的意識(shí)改變,而近幾十年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床回顧性分析結(jié)果顯示麻醉藥物本身可能對(duì)胎兒及小兒神經(jīng)發(fā)育有潛在風(fēng)險(xiǎn),這也成為越來(lái)越多臨床麻醉工作者、家長(zhǎng)及社會(huì)廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。丙泊酚(propofol,2,6-二異丙基苯酚)作為臨床上目前最常用的靜脈麻醉藥,具有起效快、蘇醒迅速、持續(xù)輸注后無(wú)蓄積、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于各類(lèi)手術(shù)的全身麻醉。有關(guān)丙泊酚對(duì)神經(jīng)毒性的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多、影響突觸發(fā)生和塑形障礙,甚至導(dǎo)致短期或長(zhǎng)期的行為學(xué)異常。雖然神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮主要功能的細(xì)胞,但是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總共占神經(jīng)細(xì)胞的50%,越是高等的動(dòng)物,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所占比例越高,而少突膠質(zhì)細(xì)胞占全部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的70%,其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結(jié)構(gòu)和維持神經(jīng)元的正常功能,而髓鞘是保證神經(jīng)信號(hào)快速、準(zhǔn)確、單向傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)。其中,髓鞘堿性蛋白MBP是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,也是髓鞘結(jié)構(gòu)的重要組成成分,在成髓鞘過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育成熟的過(guò)程中會(huì)受到多種信號(hào)的調(diào)節(jié),轉(zhuǎn)錄因子Olig2主要參與少突膠質(zhì)細(xì)胞早期的定向發(fā)育和分化,而Oligl主要在髓鞘形成的終末階段發(fā)揮作用。此外,Olig1、Olig2還可正性調(diào)控MBP啟動(dòng)序列的轉(zhuǎn)錄。近期研究發(fā)現(xiàn),新生獼猴和孕期獼猴接觸丙泊酚5h,可誘發(fā)胎兒腦部神經(jīng)元的凋亡增多,并在少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘的起始時(shí)期誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡增多,另外,胎兒期相對(duì)于新生獼猴丙泊酚暴露,大腦神經(jīng)細(xì)胞的受損情況更加嚴(yán)重。胎兒期是各類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的起始階段,也是少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化、成熟的重要時(shí)刻,此時(shí)暴露于丙泊酚是否會(huì)對(duì)胎兒發(fā)育中大腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟和髓鞘化產(chǎn)生不利影響,還需進(jìn)一步探索。我們?cè)谇捌谘芯恐薪⒘伺咛テ诎唏R魚(yú)丙泊酚暴露模型,發(fā)現(xiàn)丙泊酚可導(dǎo)致3dpf幼魚(yú)腦部神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多并在MBP生成初期下調(diào)其表達(dá)。本研究,將進(jìn)一步觀察不同發(fā)育階段的胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露所致行為學(xué)改變及MBP下調(diào)的作用機(jī)制。研究目的1.觀察胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露對(duì)不同發(fā)育時(shí)期幼魚(yú)MBP表達(dá)的持續(xù)性影響2.觀察胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露對(duì)不同發(fā)育時(shí)期幼魚(yú)行為改變3.探究胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露對(duì)引起MBP表達(dá)下降的可能機(jī)制研究?jī)?nèi)容與方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用成年野生型和轉(zhuǎn)基因Tg(mbp:GFP)、Tg(olig2:DsRed2)斑馬魚(yú),雌雄各半,魚(yú)齡6個(gè)月-1年左右,下午18:00將雌雄成魚(yú)按1:1或1:2比例配對(duì),次日待雌魚(yú)產(chǎn)卵后將胚胎收集置于28.5℃的恒溫孵箱中。6h后,用吸管吸除死卵,將剩余卵隨機(jī)分組到六孔板中,每孔30卵,加入含有200μg/m、30μg/ml丙泊酚的幼魚(yú)孵化液,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、DMSO組(0.014%),每孔5ml。24hpf時(shí)移除死卵,更換各分組一半受試液,48hpf時(shí),所有組別更換為新鮮幼魚(yú)孵化液。對(duì)需要拍照觀察的幼魚(yú),需加入0.003%PTU,抑制色素保持魚(yú)體透明。2.qRT-PCR、Western-Blot 法檢測(cè)MBP和olig2的 mRNA、蛋白表達(dá)收集不同發(fā)育階段幼魚(yú)組織,提取RNA和蛋白,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)MBP和olig2的mRNA、蛋白表達(dá)情況3.幼魚(yú)行為學(xué)檢測(cè)利用noldus行為跟蹤系統(tǒng)和分析軟件導(dǎo)出幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)參數(shù),分析行為變化4.TUNEL檢測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡收集不同發(fā)育階段Tg(mbp:GFP)幼魚(yú),制作冰凍切片,利用TUNEL、免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)凋亡情況5.吖啶橙檢測(cè)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡用吖啶橙染料對(duì)48hpf Tg(olig2:DsRed2)轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)活體凋亡染色,檢測(cè)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的凋亡情況6.EDU檢測(cè)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖使用EDU標(biāo)記S期增殖細(xì)胞,制作Tg(olig2:DsRed2)轉(zhuǎn)基因幼魚(yú)冰凍切片,并進(jìn)行染色,檢測(cè)前體細(xì)胞增殖情況7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,One-Way ANOVA單因素方差分析。分別采用LSD(方差齊時(shí))或Tamhane(方差不齊時(shí)),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism6.0作圖軟件和image J灰度值分析。研究結(jié)果1.3dpf、7dpf MBPmRNA表達(dá)下調(diào)(P0.05),3dpf、7dpf、10dpfMBP蛋白表達(dá)均下調(diào)(P0.05);olig2 mRNA、蛋白在48hpf表達(dá)下降(P0.05);DMSO組與對(duì)照組相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.5dpf幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)活力、對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力明顯減弱(P0.05),7dpf幼魚(yú)環(huán)境適應(yīng)能力、對(duì)刺激的反應(yīng)速度有所減弱(P0.05),1Odpf幼魚(yú)各項(xiàng)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.3dpf各濃度組和7dpf較高濃度組少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多(P0.05);48hpf少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡數(shù)目成濃度依賴性增多(P0.05)。4.胚胎期丙泊酚暴露后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞增殖率未發(fā)生明顯變化(P0.05)結(jié)論1.胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露后可持續(xù)抑制幼魚(yú)MBP表達(dá)至1Odpf。2.胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露可導(dǎo)致5dpf、7dpf幼魚(yú)發(fā)生行為改變。3.胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露后幼魚(yú)MBP表達(dá)減少可能與丙泊酚下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子olig2表達(dá),以及促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞的凋亡增多有關(guān)。4.胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露不會(huì)明顯抑制少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖。
【圖文】：

幼魚(yú)的安全感明顯增加，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)興奮。各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的結(jié)果顯示，５ｄｐｆ逡逑３（Ｖｇ／ｍｌ丙泊酚暴露組，，無(wú)論在黑暗還是光照周期內(nèi)，幼魚(yú)的運(yùn)動(dòng)活力與正常對(duì)逡逑照組相比明顯降低（Ｐ＜０．邋０５）（見(jiàn)圖１－４圖Ａ），說(shuō)明幼魚(yú)對(duì)外界刺激的反應(yīng)性逡逑均變?nèi)�，�?duì)強(qiáng)光與黑暗交替刺激下的環(huán)境表現(xiàn)為不適應(yīng)；而７ｄｐｆ幼魚(yú)３０ｐｇ／ｍｌ逡逑２２逡逑

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ｏｌｉｇ２蛋白在４８ｈｐｆ的表達(dá)呈劑量依賴性下降（Ｐ逡逑＜０．邋０５），而７ｄｐｆ、ｌＯｄｐｆ丙泊酸暴露組ｏｌｉｇ２蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，無(wú)顯著逡逑性差異0Ｐ＞0．邋0５）（見(jiàn)表２－７、圖２－２）。逡逑表２－７不同組別各發(fā)育時(shí)期ｏｌｉｇ２蛋白表達(dá)比較（ｉ±ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－７．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｌｉｇ２邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅｓ邋（邋ｘ土ｓ）逡逑ｇｒｏｕｐ邐ｎ邐４８ｈｐｆ邐７ｄｐｆ邐ｌＯｄｐｆ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邐３邐０．９２士邋０．０４邐ｌ邋．０４邋士０．０３邐０．９６±０．０８逡逑２０＾ｌ／ｍｌ邐３邐０．５８士邋０．０４＋邐ｌ邋．０７邋士邋０．０７邐ｌ．０５邋士邋０．０６逡逑３０（ｉｌ／ｍｌ邐３邐０．２ｌ±０．０５＋＃邐ｌ．０３邋土邋０．０５邐ｌ．００邋士邋０．０３逡逑Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ＬＳＤ邋多重比較方法邋＊尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃尸邋＜０？邋０５邋ｖｓ邋２０｝ｉｌ／ｍｌ逡逑ｎ代表實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，８０條魚(yú)／組／次逡逑４４逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R614

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉川;胚胎期斑馬魚(yú)丙泊酚暴露抑制MBP蛋白表達(dá)及機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2631430