本文關(guān)鍵詞：促紅細(xì)胞生成素衍生肽減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景近年來隨著我國(guó)人口高齡化、高血壓、糖尿病、血脂異常、肥胖、體力活動(dòng)不足、不合理飲食等冠心病主要危險(xiǎn)因素的增加,冠心病的發(fā)病率持續(xù)上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。2012年《中國(guó)心血管病報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示：2002年至2011年間我國(guó)冠心病死亡率呈上升態(tài)勢(shì),2011年冠心病死亡率在城市為95.97/10萬,農(nóng)村為75.72/10萬,并表現(xiàn)為城市高于農(nóng)村,男性高于女性,而急性心肌梗死作為冠心病最為兇險(xiǎn)的一種類型也表現(xiàn)出同樣的發(fā)病趨勢(shì)。對(duì)此如何及時(shí)有效的治療急性心肌梗死成為降低冠心病病死率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前認(rèn)為,早期成功的再灌注治療是挽救急性缺血心肌的關(guān)鍵。再灌注治療包括溶栓治療、經(jīng)皮冠脈介入治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù),可以減小心肌梗死面積,改善心肌功能,降低死亡率,成為急性心肌梗死的重要治療措施。然而,冠狀動(dòng)脈在血供迅速改善的同時(shí)可造成嚴(yán)重的心肌損傷,即心肌缺血再灌注損傷myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),表現(xiàn)為嚴(yán)重的心律失常、內(nèi)皮功能障礙、心肌頓抑、細(xì)胞死亡等,減少了再灌注血流所帶來的獲益。因此,如何有效減輕這種損傷,使再灌注治療最大獲益成為急性心肌梗死治療的最大挑戰(zhàn)。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白激素,因其良好的促進(jìn)造血功能而廣泛應(yīng)用于臨床。近十年來體內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)EPO還可作為一種保護(hù)因子,作用于機(jī)體多種組織器官,包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、腎臟等,通過減少細(xì)胞凋亡、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)、促血管生長(zhǎng)等發(fā)揮其組織保護(hù)作用。其中,EPO在心肌梗死、心力衰竭、心肌缺血再灌注損傷等模型中良好的心肌保護(hù)作用更是受到廣泛關(guān)注。但EPO需要大劑量才能發(fā)揮組織保護(hù)作用,會(huì)造成對(duì)骨髓造血系統(tǒng)的過度刺激,引起紅細(xì)胞、血小板增多,使血液粘度增加、循環(huán)阻力增大,增大高血壓和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。近年來幾個(gè)大型臨床研究中,EPO因血栓及高血壓等不良反應(yīng),使其臨床推廣受到限制。EPO有兩種受體亞型：同源二聚受體(EPOR)2和異二聚體復(fù)合物EPOR-βCR。EPO的促紅作用是由(EPOR)2受體介導(dǎo)的,而組織保護(hù)效應(yīng)是由EPOR-βCR受體介導(dǎo)的。研究證實(shí),敲除βcR基因可完全消除EPO對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)及心臟的組織保護(hù)作用；2008年Brines等根據(jù)這一特點(diǎn),在與經(jīng)典的促紅受體(EPOR)2不結(jié)合的helix B段親水表面篩選了11個(gè)氨基酸(序列為：QEQLERALNSS),合成了螺旋B表面肽(helix B surface peptide, HBSP),即促紅細(xì)胞生成素衍生肽,并證實(shí)其具有神經(jīng)組織保護(hù)作用而無促進(jìn)紅細(xì)胞生成的副作用。HBSP因其良好的臨床應(yīng)用前景而受到廣泛關(guān)注,其在各種病理生理?xiàng)l件下的作用被廣泛研究。有研究顯示,HBSP能顯著減輕小鼠腎臟缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞損傷程度和凋亡水平。Ueba H等發(fā)現(xiàn)HBSP可以抑制TNF-a誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Ahmet I等通過結(jié)扎前降支建立大鼠心梗后心衰模型,發(fā)現(xiàn)HBSP能夠減慢大鼠心梗后心室重塑和心衰的進(jìn)程,改善心功能,并降低死亡率。另一項(xiàng)研究表明,HBSP能減輕大鼠心肌梗死中的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥,減小心肌梗死面積,這一保護(hù)作用與ERK1/2, STAT3通路的激活有關(guān)。然而HBSP在心肌缺血再灌注損傷中是否起保護(hù)作用國(guó)外尚無相關(guān)報(bào)道,其作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,探討HBSP后處理在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其可能機(jī)制,有望為HBSP的多種組織保護(hù)作用提出新的見解,為心肌缺血再灌注損傷的臨床防治提供新的理論依據(jù)。研究目的1.建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型,證實(shí)HBSP后處理在心肌缺血再灌注損傷中的作用。2.探索HBSP在小鼠MIRI中發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。研究方法1.研究對(duì)象及實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)ICR小鼠(雄性,體重25-30g)為研究對(duì)象。小鼠被隨機(jī)分成4組：(1)假手術(shù)(sham)組：小鼠冠狀動(dòng)脈前降支只穿線但不結(jié)扎,在穿線40min時(shí)予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg);(2)缺血再灌注(MIRI)組：予行缺血再灌注處理,再灌前5min予腹腔注射生理鹽水(10ml/kg);(3) HBSP組：予行缺血再灌注處理,再灌前5min予腹腔注射HBSP (90μg/kg, 10ml/kg);(4) HBSP+PD98059組：予行缺血再灌注處理,再灌前20min予腹腔注射ERK1/2特異性阻斷劑PD98059 (1mg/kg),再灌前5min予腹腔注射HBSP (90μg/kg,10ml/kg)。2.小鼠MIRI模型的建立小鼠稱重后經(jīng)腹腔注射甲苯噻嗪(5mg/kg)及氯胺酮(100mg/kg)麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,連接肢體心電圖電極,描記標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。經(jīng)口行氣管插管,連接小動(dòng)物呼吸機(jī)。備皮并消毒后,經(jīng)胸骨左緣第3-4助間行開胸術(shù),暴露左心耳,在其下約1mm處,用8-0號(hào)縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,可見結(jié)扎線以下心肌變白。心電圖實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄,ST段持續(xù)抬高說明造模成功,缺血45min后解除結(jié)扎線,再灌注120min。以ST段下移及缺血心肌漸恢復(fù)紅潤(rùn)為再灌注成功標(biāo)志。3.小鼠心肌梗死面積的測(cè)定再灌注2h后,原位結(jié)扎左前降支,采用伊文氏藍(lán)和2,3,5—氯化三苯基四氮唑(TTC)雙染法檢測(cè)小鼠心肌梗死面積。缺血危險(xiǎn)區(qū)(area at risk, AAR)為無藍(lán)染的區(qū)域,梗死區(qū)域?yàn)榘咨?存活心肌被染成磚紅色。用Image J圖像分析軟件測(cè)定心梗面積(infarct size, IS),計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)面積/左室面積(AAR/LV)及梗死面積/危險(xiǎn)區(qū)面積(IS/AAR)的比值。4.血清LDH和CK的測(cè)定再灌注2h后,取心臟之前,經(jīng)心尖取血0.5-1.0m1,以3000r/min離心10mmin,取血清于-20℃中保存?zhèn)溆�。采用ELISA法檢測(cè)各組乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)水平。5.心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)再灌注2h后,取心臟固定、包埋、切片,采用TUNEL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,以LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察記錄結(jié)果。每只小鼠計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)高倍視野中TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)。計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞核數(shù)的百分比即為凋亡率。6.ERK1/2、磷酸化ERKl/2及cleaved caspase3表達(dá)的檢測(cè)再灌注2h后,取結(jié)扎線以下左室心肌,將心肌組織剪碎研磨,加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白。蛋白定量后,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,采用5%脫脂牛奶封閉1h后分別加入各自稀釋后的一抗,4℃共孵過夜,TBST洗膜兩次,分別加入相應(yīng)二抗(1：2000稀釋),37℃孵育1h, TBST洗膜三次后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。采用Image pro plus 6.0軟件分析目標(biāo)條帶光密度值。研究結(jié)果1. HBSP后處理減少小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面積再灌注2h后,與MIRI組相比,HBSP組心肌梗死面積明顯縮小,HBSP+PD98059組心梗面積較HBSP組有所增加[三組IS/AAR分別為(47.1±7.4)%、(24.2±3.8)%和(38.4±2.2)%,P0.05],說明HBSP后處理能夠減少小鼠MIRI后心肌梗死面積,而給予ERK1/2特異性阻斷劑PD98059后,HBSP的這種保護(hù)作用被部分抑制。各組AAR/LV無明顯差異(P0.05)。2. HBSP后處理減少小鼠心肌缺血再灌注后LDH和CK的釋放再灌注2h后,MIRI組LDH水平明顯高于sham組(878.2±133.0 vs.175.5±53.4U/L,P0.05)；而HBSP組與MIRI組相比,LDH明顯降低(625.5±110.7vs.878.2±133.0U/L,P0.05); HBSP+PD98059組LDH較HBSP組有所升高(742±117.4 vs.625.5±110.7U/L, P0.05)。與sham組相比,MIRI組CK水平顯著升高(P0.05)；而與MIRI組相比,HBSP組CK明顯降低(P0.05)；HBSP+PD98059組CK較HBSP組有所升高(P0.05)。3. HBSP后處理減輕小鼠心肌缺血再灌注后的心肌細(xì)胞凋亡再灌注2小時(shí)后,與sham組相比,MIRI組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P0.05)；而同MIRI組相比,HBSP組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P0.05)；HBSP+PD98059組細(xì)胞凋亡率較HBSP組增加(P0.05),四組的細(xì)胞凋亡率分別為(5.5±1.1)%、(29.4+5.1)%、(15.0±2.3)%和(21.8±2.5)%。4. HBSP后處理抑制小鼠心肌缺血再灌注后的cleaved caspase3的表達(dá)再灌注2h后,MIRI組cleaved caspase3表達(dá)較sham組顯著升高(1.75±0.21 vs.0.29±0.06,P0.05)；而HBSP組與MIRI組相比,cleaved caspase3表達(dá)明顯降低(0.60±0.12vs.1.75±0.21,P0.05); HBSP+PD98059組cleaved caspase3表達(dá)較HBSP組有所升高(1.04±0.12 vs.0.60±0.12,P0.05)。5. HBSP后處理提高小鼠心肌缺血再灌注后ERK1/2的磷酸化水平再灌注2小時(shí)后,MIRI組磷酸化ERKl/2水平較sham組升高(P0.05)；與MIRI組相比,HBSP可以上調(diào)磷酸化ERK1/2的表達(dá)(P0.05)；而在給予ERKl/2特異性阻斷劑PD98059后,ERKl/2的磷酸化被顯著抑制(P0.05)。結(jié)論HBSP后處理可以減輕小鼠MIRI中的心肌細(xì)胞損傷,抑制心肌細(xì)胞凋亡,縮小心肌梗死面積,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。其機(jī)制與ERK1/2通路的激活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 促紅細(xì)胞生成素衍生肽 細(xì)胞凋亡 ERK1/2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與材料23-25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法25-43
• 1.3 結(jié)果43-49
• 1.4 討論49-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 綜述60-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 中英文縮略詞對(duì)照表68-69
• 攻讀學(xué)位期間成果69-70
• 致謝70-72

【共引文獻(xiàn)】

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