發(fā)布時間：2019-11-15 03:11

【摘要】：目的： 近年來，隨著人口老齡化和我國醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，老年患者、心臟疾病行非心臟手術(shù)患者以及心臟手術(shù)患者逐年增多，圍手術(shù)期心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion, I/R)損傷的風(fēng)險也相應(yīng)增加。心肌缺血/再灌注損傷是圍手術(shù)期患者并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率增加的重要原因[1]。因此，為圍手術(shù)期患者提供有效的心肌保護(hù)仍是臨床醫(yī)生必須解決的難題。缺血預(yù)處理(Ischemia Preconditioning, IPC)是通過觸發(fā)機(jī)體內(nèi)源性抗損傷機(jī)制而增強(qiáng)心肌細(xì)胞對缺血缺氧的耐受能力。IPC的保護(hù)作用呈雙相過程，第一相稱為預(yù)處理的快速相，，出現(xiàn)在預(yù)處理的數(shù)分鐘，持續(xù)1-3h。第二相稱為預(yù)處理的延遲相(SecondWindow of Protection, SWOP)，出現(xiàn)在初次缺血后的12-72h。研究結(jié)果表明，IPC時心肌保護(hù)效果最強(qiáng)的時間位點是在延遲相[2][3][4]。圍手術(shù)期麻醉藥物，如嗎啡等阿片類藥、七氟醚和異氟醚等吸入性麻醉藥等都能通過SWOP產(chǎn)生心肌保護(hù)作用[5][6][7]。然而，由于SWOP的作用機(jī)制尚未完全闡明，從而限制了SWOP在臨床上的廣泛應(yīng)用。 有蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，SWOP可使心肌線粒體呼吸鏈中的多個蛋白表達(dá)上調(diào)[8]，這提示線粒體呼吸鏈的蛋白表達(dá)上調(diào)可能在SWOP中具有重要意義。泛醇-細(xì)胞色素c還原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome c reductase core protein1, UQCRC1)是線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ上的一個亞單位，具有重要的生理功能。我們前期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，UQCRC1的表達(dá)改變與大鼠心肌的SWOP呈正相關(guān)。由此，我們推測UQCRC1可能在SWOP中起了重要作用，它可能是又一新發(fā)現(xiàn)的保護(hù)性蛋白。 近年來的研究結(jié)果表明，線粒體KATP通道是IPC和藥物預(yù)處理如嗎啡、舒芬太尼、七氟醚、異氟醚等延遲預(yù)處理的共同“終末效應(yīng)器”[1][2][3][4]，開放線粒體KATP通道是它們產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的共同信號通路。二氮嗪(Diazoxide, DZ)是線粒體KATP通道的特異性開放劑。因此，本研究選用二氮嗪的SWOP來研究UQCRC1在延遲預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用及機(jī)制，具有很好的代表性。 本研究采用腺病毒載體與RNA干擾技術(shù)，通過大鼠H9C2心肌細(xì)胞UQCRC1基因的過表達(dá)和表達(dá)沉默，并且建立氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation, OGD)模型模擬缺血/再灌注損傷，研究UQCRC1在二氮嗪延遲預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞抗缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制，為研發(fā)以UQCRC1作為分子靶點的心肌保護(hù)藥物和闡明SWOP心肌保護(hù)的機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法： 1、本實驗合成三種不同的siUQCRC1序列，采用RT-PCR和Western Blot等方法檢測不同序列和不同濃度的siUQCRC1對UQCRC1基因和蛋白表達(dá)的影響,從中篩選出最有效的siUQCRC1序列和最佳有效濃度。 2、構(gòu)建UQCRC1腺病毒載體，采用Western Blot法檢測UQCRC1過表達(dá)、二氮嗪即時和延遲預(yù)處理后H9C2心肌細(xì)胞UQCRC1蛋白的表達(dá)，以及采用線粒體KATP通道特異性阻滯劑5-羥葵酸(5-hydroxydecanote,5-HD)進(jìn)行干擾實驗，觀察SWOP后UQCRC1的表達(dá)水平及其與線粒體KATP通道開放的關(guān)系。 3、采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率、Hoechst33342熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞、四甲基羅丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester, TMRE)熒光染色標(biāo)記線粒體膜電位等方法，觀察SWOP對OGD損傷后H9C2心肌細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率和線粒體膜電位的影響及其與UQCRC1表達(dá)的關(guān)系。 4、采用Western Blot法檢測H9C2心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax及Cox-2蛋白表達(dá)，OGD損傷后active caspase-3的表達(dá)以及pho-Akt（Ser473）、Akt、pho-GSK3β（S9）、GSK3β蛋白的表達(dá)，觀察SWOP和UQCRC1表達(dá)對心肌細(xì)胞保護(hù)性蛋白Bcl-2、Cox-2等表達(dá)、OGD損傷后caspase-3細(xì)胞凋亡信號和Akt/GSK-3β細(xì)胞保護(hù)信號激活的影響。 結(jié)果： 1、靶序列為CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列對UQCRC1mRNA的抑制作用最顯著，該序列在轉(zhuǎn)染濃度為200nmol/L時對UQCRC1蛋白的表達(dá)抑制作用最佳。 2、二氮嗪延遲預(yù)處理能顯著上調(diào)UQCRC1蛋白的表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)是通過開放線粒體KATP通道來實現(xiàn)的；采用5-HD使二氮嗪預(yù)處理時線粒體KATP通道關(guān)閉，則能完全消除二氮嗪延遲預(yù)處理后UQCRC1的表達(dá)上調(diào)，同時其心肌保護(hù)作用也隨之消失。 3、SWOP是通過上調(diào)表達(dá)UQCRC1而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的。UQCRC1表達(dá)上調(diào)能顯著增加OGD損傷后心肌細(xì)胞的存活率、減少細(xì)胞凋亡和保持線粒體膜電位；而抑制SWOP后的UQCRC1表達(dá)上調(diào)，則能完全消除SWOP對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。 4、SWOP通過上調(diào)H9C2心肌細(xì)胞UQCRC1的表達(dá)，繼而使細(xì)胞保護(hù)性蛋白Bcl-2和Cox-2等表達(dá)增加、Bcl-2/Bax比率增高，從而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)；而下調(diào)UQCRC1表達(dá)能消除SWOP對心肌細(xì)胞Bcl-2和Cox-2蛋白表達(dá)的影響。 5、SWOP后心肌細(xì)胞UQCRC1的表達(dá)上調(diào)能顯著抑制OGD損傷后active caspase-3蛋白的表達(dá)、增加磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表達(dá)；下調(diào)UQCRC1的表達(dá)則能完全消除SWOP對active caspase-3、磷酸化的GSK-3β和Akt蛋白表達(dá)的影響，同時也消除了OGD損傷后的心肌細(xì)胞保護(hù)。 結(jié)論： 1、轉(zhuǎn)染濃度為200nmol/L、靶序列為CCGUUGCUGUAGCUAACAAdTdT的siUQCRC1序列，能有效抑制H9C2心肌細(xì)胞UQCRC1的表達(dá)。 2、二氮嗪延遲預(yù)處理通過開放線粒體KATP通道而上調(diào)UQCRC1蛋白表達(dá)，從而對心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷起到保護(hù)作用。 3、上調(diào)Bcl-2、Cox-2等保護(hù)性蛋白的表達(dá)、抑制缺血/再灌注損傷后caspase-3凋亡信號通路激活、激活A(yù)kt/GSK-3β細(xì)胞保護(hù)信號通路，是UQCRC1在SWOP中抗心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的作用機(jī)制。 4、UQCRC1是SWOP中的保護(hù)性蛋白，它可能成為心肌保護(hù)的新靶點。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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3 孫飛;周強(qiáng)軍;孫吉;翟宇佳;饒子和;;線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[J];生命科學(xué);2008年04期

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6 吳瀟瀟;李洪;易婷婷;楊天德;;Uqcrc1的RNA干擾片段篩選及其對H9C2心肌細(xì)胞耐受缺氧/復(fù)氧損傷的影響[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年24期

本文編號：2561118