【摘要】：背景 血管的慢性炎癥貫穿整個動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的發(fā)生發(fā)展過程。特別是在動脈粥樣硬化早期階段,內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮了主要的作用。在多種致病因素的作用下,血管內(nèi)皮細(xì)胞活化,粘附分子、致炎細(xì)胞因子及化學(xué)趨化因子的表達(dá)增加,協(xié)助炎癥細(xì)胞浸潤,造成內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激增加,細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)沉積,最終導(dǎo)致動脈硬化的發(fā)生。 轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)活化與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。NF-κB是由P50, P52, P65, Re1B和c-Rel等五種分子組成的同源或異源二聚體并參與調(diào)控體內(nèi)病理生理如免疫、炎癥、增殖等過程。在細(xì)胞處于正常狀態(tài)時,NF-κB的組成成分限制在胞漿中,而當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后,NF-κB抑制因子(IκBs)被其上游的IκB激酶(IKK)復(fù)合物激活,發(fā)生磷酸化,隨后被泛素化及蛋白酶體降解,最終導(dǎo)致NF-κB(主要是P65/P50二聚體形式)的釋放并由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核,參與調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。 在動脈粥樣硬化形成的過程中,氧化應(yīng)激發(fā)揮著重大作用。氧化應(yīng)激是過量的活性氧與內(nèi)源性清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)間失去平衡。活性氧影響血管內(nèi)皮的很多功能,如介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長、凋亡和存活等表型調(diào)節(jié),內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張,參與血管壁缺失一氧化氮(NO)生物活性而損傷,增加單核細(xì)胞粘附和在血管生成中起作用。 丹皮酚磺酸鈉(Sodium Paeonolsilate, SPae)是從中藥牡丹皮中分離提取的丹皮酚經(jīng)磺化、成鹽形成的一種新的化合物,具有抗炎、止痛、抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、免疫調(diào)節(jié)等多重作用,近年有研究表明其具有抗動脈粥樣硬化作用,但具體作用機(jī)制仍不清楚。因此,我們觀察了丹皮酚磺酸鈉對血管炎癥影響,并探討其可能的作用機(jī)制。 目的 1.研究丹皮酚磺酸鈉對腫瘤壞死因子α (TNF-a)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞粘附分子、致炎因子及化學(xué)趨化因子受體表達(dá)的影響。 2.研究丹皮酚磺酸鈉對TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB活性、氧化應(yīng)激的影響及可能的機(jī)制。 方法 1)人動脈內(nèi)皮細(xì)胞1human aortic endothelial cells, HAECs)的培養(yǎng) 人動脈內(nèi)皮細(xì)胞(himan aortic endothelial cells, HAECs)培養(yǎng)在含有10%FBS的ECM培養(yǎng)基中,置于5%C02,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每三天換一次液,并根據(jù)需要進(jìn)行傳代和鋪板。 2)細(xì)胞模型的建立 HAECs與5,10和20ng/ml的fNF-α共孵育24h, Western Blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)。 3)單核細(xì)胞粘附實驗 用終濃度為5μmol/L的鈣黃綠素-AM (calcein-AM)標(biāo)記的THP-1細(xì)胞接種在HAECs上。避光條件下,37℃共同孵育2h。用PBS輕輕清洗細(xì)胞2-3次,去除未粘附的單核細(xì)胞,加入2mlPBS,于激光共聚焦顯微鏡下觀察,激發(fā)波長485nm,發(fā)射波長530nm。 4) ROS檢測 按照ROS試劑盒操作說明,運用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探針檢測丹皮酚磺酸鈉處理后,細(xì)胞內(nèi)超氧化物的釋放情況。 5) NO、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測 按照NO、SOD、LDH試劑盒操作測定一氧化氮、超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶。 6) Western blot蛋白檢測 檢測丹皮酚磺酸鈉處理后,細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達(dá),磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS),以及NF-κB.p-IKKβ活性。 7)小鼠在體炎癥模型的建立 本實驗采用30μg/kg TNF-α經(jīng)腹腔注射(i.p.)48h建立小鼠在體炎癥模型。 8)血清中ICAM-1、VCAM-1、白介素8(IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)檢測 取動脈血,按照ELISA試劑盒說明,檢測血漿中ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1水平。 免疫組化 麻醉小鼠,取出胸主動脈,蔗糖梯度溶液中脫水,石蠟包埋組織,石蠟切片機(jī)切片,主動脈按冠狀切面切取厚度為4μm的組織切片,-80℃保存。按照操作步驟進(jìn)行ICAM-1和VCAM-1的組織染色。 結(jié)果 1.丹皮酚磺酸鈉能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的表達(dá),減少活性氧簇(ROS)釋放,增加NO、SOD的生成。 2.丹皮酚磺酸鈉上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞eNOS磷酸化水平和降低NF-κB活性及p-IKKβ的表達(dá)。 3.丹皮酚磺酸鈉在體模型上抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)。 結(jié)論 丹皮酚磺酸鈉能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的表達(dá),減少活性氧簇(ROS)釋放,增加NO、SOD的生成,降低血管炎癥反應(yīng),維持內(nèi)皮細(xì)胞正常功能。 背景 巨噬細(xì)胞泡沫化和炎癥因子在動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。內(nèi)皮功能障礙被是AS的始動因素,而脂質(zhì)代謝紊亂是AS發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。氧化應(yīng)激一方面引起內(nèi)皮損傷,另一方面修飾LDL成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。 ox-LDL-一方面加劇內(nèi)皮炎癥,另一方面加速巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞。而泡沫細(xì)胞凋亡或壞死后,將細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)釋放出來,形成條紋狀粥樣硬化斑塊。由此可見,泡沫細(xì)胞的形成在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中同樣扮演著一個十分重要的角色。 從中藥牡丹皮中分離提取的丹皮酚經(jīng)磺化、成鹽形成的丹皮酚磺酸化鈉(Spae),具有抗炎、止痛、抗腫瘤、抗脂質(zhì)過氧化、免疫調(diào)節(jié)等多重作用,我們上一章節(jié)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SPae具有抵抗腫瘤壞死因子α(TNF-a)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激效應(yīng)和抗血管炎癥。同時,眾多研究證明細(xì)胞泡沫化形成也伴隨著炎癥的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的的繼續(xù),我們進(jìn)一步觀察SPae是否抑制ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和動脈粥樣硬化形成。 為此,本課題從以下三個方面在細(xì)胞模型和在體模型探討SPae對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化和動脈粥樣硬化形成的影響。1.建立巨噬細(xì)胞泡沫化細(xì)胞模型,并觀察SPae對巨噬細(xì)胞泡沫化吞噬ox-LDL能力的影響,以及對清道夫受體CD36、清道夫受體A (SRA)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)的表達(dá)的影響；2.采用apoE-/-小鼠動脈硬化模型,研究SPae對AS的治療作用；3.從分子水平探討其潛在的作用機(jī)制。 目的： 1)研究APse對巨噬細(xì)胞泡沫化形成的影響 2)探討載體模型中,SPae對AS早期斑塊發(fā)展的影響。 方法： 1)巨噬細(xì)胞泡沫化模型建立與鑒定 THP-1細(xì)胞經(jīng)10Ong/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)誘導(dǎo)分化24h后,80μg/mL ox-LDL處理分化后的細(xì)胞24h。用預(yù)冷PBS洗2次,60%異丙醇固定5min,0.3%油紅O染色液染色15min,洗去染色液,倒置顯微鏡下觀察,巨噬泡沫細(xì)胞內(nèi)有大量紅色脂肪滴的存在,表明THP-1巨噬細(xì)胞已經(jīng)泡沫化。 2)藥物處理方法 隨機(jī)分為6組,分別為正常組、高劑量對照組、模型組、高劑量治療組、中劑量治療組、低劑量治療組。其中模型組為80μg/mL的ox-LDL處理THP-1巨噬細(xì)胞24h, SPae治療組中SPae預(yù)孵育2h后,加入80μg/mL的ox-LDL共孵育24h,高、中、低劑量分別是40μM、20μM、10μM SPae。 3)油紅O染色 按照方法2處理好的細(xì)胞,用60%異丙醇固定5min,0.3%油紅O染色液染色15min,PBS洗2遍,水性封片劑封片。熒光顯微鏡下白光觀察,隨機(jī)拍照。 4)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的測定及ROS、NO、SOD檢測 按照方法2處理好的細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞內(nèi)膽固醇測定試劑盒說明書,檢測細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、膽固醇酯的含量；及按照ROS、NO、SOD各試劑盒操作測定活性氧族、一氧化氮、超氧化物歧化酶。 5)SPae對THP-1巨噬細(xì)胞與Dil-oxLDL結(jié)合的影響 4-C下10μg/mL Dil-oxLDL與按照方法2處理好的細(xì)胞孵育2h,PBS洗3次,用激光共聚焦顯微鏡(400×)隨機(jī)拍照,激發(fā)波波長520nm和發(fā)射波波長580nm。 6)SPae對THP-1巨噬細(xì)胞與Dil-oxLDL攝取的影響 4-C下10μg/mL Dil-oxLDL與按照方法2處理好的細(xì)胞孵育4h,PBS洗3次,用激光共聚焦顯微鏡(400×)隨機(jī)拍照,激發(fā)波波長520nm和發(fā)射波波長580nm。 7)SPae對THP-1巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36與SR-A表達(dá)的影響 按照方法2處理好的細(xì)胞,Western Blot分析SPae對THP-1巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36與SR-A表達(dá)的影響。 8)SPae對THP-1巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)的表達(dá)的影響 按照方法2處理好的細(xì)胞,Western Blot分析SPae對THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)的影響。 9)檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、 NF-κB、P38、JNK以及氧化應(yīng)激的影響。 Western Blot檢測ox-LDL對THP-1巨噬細(xì)胞的NF-κB抑制因子α(IκBα)、IκB激酶β (IKKβ)、P38、pP38、PPARγ、JNK和P-JNK蛋白表達(dá)的影響。按照NO、SOD、LDH試劑盒操作測定一氧化氮、超氧化物歧化酶、活性氧。 10)apoE-/-小鼠動脈硬化模型的建立 選用15只雄性apoE基因敲除小鼠,3只野生型雄性C57BL/6J小鼠組,其中apoE基因敲除小鼠隨機(jī)分成5組,分別是模型組、高劑量對照組、高劑量防治組、中劑量防治組、低劑量防治組,每組3只。實驗開始時,所有動物同步給藥,每天給藥一次,并同時高脂喂食,連續(xù)給藥喂食12周。 11)免疫組化與免疫熒光 麻醉小鼠,取出解剖分離心臟,主動脈,蔗糖梯度溶液中脫水,OCT包埋組織,冰凍切片機(jī)切片,主動脈按冠狀切面切取厚度為81μm的組織切片,-80℃保存。油紅O染色,倒置顯微鏡下觀察主動脈竇部和主動脈紅色的動脈粥樣硬化斑塊的情況；免疫組化的方法檢測斑塊內(nèi)1mac-3、VCAM-1的水平；應(yīng)用免疫熒光的方法,檢測PECAM-1,評價主動脈根部血管內(nèi)皮完整性。 12)血清ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、MCP-1、IL-8和LDL-C水平水平 小鼠麻醉后,自小鼠摘除眼球,分離血清,并分別檢測血清ICAM-1、 VCAM-1、TNF-α、MCP-1和IL-8水平和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。 結(jié)果： 1)巨噬細(xì)胞泡沫化模型建立成功； 2)SPae濃度依賴性抑制THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化的形成； 3)SPae一方面抑制THP-1巨噬細(xì)胞SRA和CD36的表達(dá),降低THP-1巨噬細(xì)胞與Dil-ox-LDL的結(jié)合和攝取能力,另一方面提高ABCA1的表達(dá),加強(qiáng)胞內(nèi)游離膽固醇逆轉(zhuǎn)運出細(xì)胞； 4)小鼠在體模型顯示,SPae抑制動脈硬化斑塊蓄積,同時減輕在體炎癥反應(yīng)。 結(jié)論： SPse可調(diào)控PPARγ和NF-κB活性和氧化應(yīng)激反應(yīng),調(diào)控清道夫受體和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1的表達(dá),并調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化過程中炎癥的產(chǎn)生,達(dá)到抗動脈粥樣硬化的目的。 背景 與非糖尿病患者相比,糖尿病能顯著增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率。迄今為止,冠脈支架已廣泛地應(yīng)用于臨床急性冠心病事件；它可以明顯地改善患者的臨床預(yù)后,且具有較高的操作成功率和良好的早期臨床效果。雖然傳統(tǒng)的金屬裸支架已深入應(yīng)用于各種冠心病患者,并取得了一定的療效；然而,其長期預(yù)后和再狹窄率一直困擾著臨床醫(yī)師。近些年來,西羅莫司洗脫支架被用來治療裸金屬支架術(shù)后再狹窄和初次冠脈狹窄,并取得長足的進(jìn)步。一直來,國內(nèi)外對冠心病合并糖尿病-------這群特殊患者的治療探索從未停頓；但其在不同的臨床試驗中,西羅莫司洗脫支架和裸金屬支架治療該類患者的療效和安全性,仍具相當(dāng)?shù)臓幾h性。 目的 通過Meta分析方法,在較大樣本量的前提下,評價西羅莫司洗脫支架與金屬裸支架治療冠心病合并糖尿病的西方人群和中國人群的臨床療效和安全性。 方法 制定了詳細(xì)的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)后,同時根據(jù)擬定的上述標(biāo)準(zhǔn)制定出全面、系統(tǒng)的檢索策略；要求所選擇的文獻(xiàn)設(shè)計類型為國內(nèi)外的臨床對照實驗。中文檢索關(guān)鍵詞：雷帕霉素洗脫支架；西羅莫司洗脫支架；金屬裸支架；糖尿病；冠心病。英文檢索關(guān)鍵詞：rapamycin eluting stent; sirolimus eluting stent; bare metal stents; diabetes; coronary arterial disease。按照改良Jadad評分標(biāo)準(zhǔn),兩位獨立的研究人員對納入研究的每篇文獻(xiàn)做質(zhì)量評價,遇到爭議之處,通過協(xié)商解決；無法達(dá)成一致時,向第三位評價者詢問,1-3分為低質(zhì)量,4-7分為高質(zhì)量。納入文獻(xiàn)的結(jié)果測量指標(biāo)為二分類變量,采用優(yōu)勢比(Odds Ratio, OR)作為療效分析的統(tǒng)計量,使用95%可信區(qū)間(confidence interval, CI)表示。統(tǒng)計結(jié)果以森林圖表示。分別用漏斗圖、Begger's和Egger's檢驗三種方法評估發(fā)表偏倚。 結(jié)果 最終納入18篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)。包括西羅莫司洗脫支架組的1764例和金屬裸支架組的1912例病例。西方人群的10篇文獻(xiàn)得分在2-7之間,其中2篇低質(zhì)量文獻(xiàn),8篇屬于高質(zhì)量文獻(xiàn)；而中國人群的8篇文獻(xiàn)得分在1-2之間,均屬于低質(zhì)量文獻(xiàn)。在西方人群的研究,SEM組的靶病變血運重建率均顯著的低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.26,95%可信區(qū)間為(0.16,0.45)；在中國人群的研究,SEM組的靶病變血運重建率均顯著的低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.30,95%可信區(qū)間為(0.14,0.62)。在西方人群的研究,SEM組的心肌梗死發(fā)生率低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.94,95%可信區(qū)間為(0.66,1.35)；在中國人群的研究,SEM組的心肌梗死發(fā)生率低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.64,95%可信區(qū)間為(0.31,1.31)。西方人群的研究SEM組的平均死亡率高于BMS組,合并效應(yīng)量為1.11,95%可信區(qū)間為(0.72,1.73),而中國人群的研究SEM組的平均死亡率低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.62,95%可信區(qū)間為(0.22,1.76)。西方人群的研究,SEM組的主要心血管不良事件發(fā)生率顯著的低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.40,95%可信區(qū)間為(0.28,0.58)；中國人群的研究,SEM組的主要心血管不良事件發(fā)生率顯著的低于BMS組,合并效應(yīng)量為0.25,95%可信區(qū)間為(0.15,0.42)。西方人群的亞組分析顯示SEM組的主要心血管不良事件發(fā)生率顯著的低于BMS組,當(dāng)樣本量≤90,合并效應(yīng)量為0.30,95%可信區(qū)間為(0.19～0.47)；隨機(jī)對照試驗的亞組分析,合并效應(yīng)量為0.30,95%可信區(qū)間為(0.22～0.40)；歐洲人群的亞組分析,合并效應(yīng)量為0.42,95%可信區(qū)間為(0.32～0.56)。 結(jié)論 1、在西方人群與中國人群的研究,SEM組的靶病變血運重建率均顯著的低于BMS組。 2、在西方人群與中國人群的研究,SEM組的心肌梗死發(fā)生率均低于BMS組,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 3、西方人群的研究SEM組的平均死亡率高于BMS組,而中國人群的研究SEM組的平均死亡率低于BMS組,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 4、在西方人群與中國人群的研究,SEM組的主要心血管不良事件發(fā)生率均顯著的低于BMS組。 SEM較BMS更加適合治療伴有糖尿病的冠心病患者。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R541.4;R587.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2557055